【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物产品分离提纯领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法。
技术介绍
1、β-烟酰胺单核苷酸(nmn)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的前体，近年来的研究表明，通过调节生物体内的nmn水平，能有效防治衰老引起的各种疾病，对治疗帕金森等老年病，调节胰岛素分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病具有较好的修复和医疗保健效果。
2、目前nmn的大规模生产主要是通过酶促反应实现的，相比化学合成法，酶催化法更为高效，绿色，环保，但酶催化反应液中的杂质往往比较复杂，含有大量的盐及二价金属离子，还包含一些副反应产物、酶催化蛋白、糖类、多磷离子等杂质。而市场对nmn的纯度需求较高，目前阶段nmn主要分离纯化方法为离子交换法、反向层析法等。
3、专利cn111424064a公开了一种基于酶法的反向层析法制备高纯度nmn的方法，反应液经反向液相色谱梯度洗脱分离，再经纳滤浓缩，结晶，得到高纯度的nmn产品。但反向层析填料昂贵，成本较高。
4、专利cn108026132a公开了一种基于生物催化法的离子交换法纯化nmn的方法，该方法将生物催化法制备的粗品反应液经阴离子树脂处理，纳滤浓缩后，再经螯合树脂处理，纳滤浓缩后冻干得到nmn纯品。但离子树脂对反应液中的杂质去除效果有限，体系中的大量的盐导致上样量小，纯化效率低，再生用水量大，三废增加。
5、酶反应过程中产生部分副反应，其中nmn分解产生的烟酸单核苷酸与产品性质相似，并且在用离子交换树脂吸附洗脱解离产品的过程还会导致nmn进一步分解，
6、因此，需要开发一种新的分离纯化方法，有效分离酶法制备的nmn中的杂质。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种用大孔吸附树脂分离提纯β-烟酰胺单核苷酸的方法，解决酶反应体系含盐量高，杂质复杂，去除困难，纯化效率低的问题。
2、酶反应制备的nmn粗品溶液中成分复杂，体系含盐量高，有大量磷酸盐和多磷离子，还有部分副反应产物，如烟酸单核苷酸，烟酰胺核糖(nr)，5-磷酸核糖，烟酸等，以及未反应完全的原料烟酰胺和核糖等。其中烟酸单核苷酸与产品结构相近，很难通过离子交换树脂等常规方法彻底去除。通过对nmn的性质研究发现，nmn是一个两性分子，在等电点时为内盐形态，在高于等电点和低于等电点时呈阴离子和阳离子形态，本专利技术利用该特性，在烟酰胺单核苷酸的等电点3.7附近选择合适的ph，使nmn呈内盐形态，吸附到大孔吸附树脂上，而烟酸单核苷酸在这个ph下为阴离子形态，不被树脂吸附。通过简单水洗即可将体系内的磷酸盐，多磷离子，以及烟酸单核苷酸，烟酰胺核糖等杂质彻底去除，再解吸附即得到高纯度的nmn产品。
3、基于此，本专利技术提供的一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：步骤一：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的ph值调节至3.5-4.8，得到待纯化液；
4、步骤二：将待纯化液流经装有大孔吸附树脂的分离柱，用纯水洗脱盐和杂质，再用醇溶液洗脱产品，收集洗脱液；
5、步骤三：纯化洗脱液，得到纯化后的β-烟酰胺单核苷酸成品。
6、在一个实施方案中，步骤一中所述含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液为：以d-核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸atp、多聚磷酸盐为原料，在磷酸核糖焦磷酸合成酶、核糖激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的共同催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸得到的反应液。
7、在一个实施方案中，步骤一为：向含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的ph值调节至3.5-4.8，得到待纯化液，或者为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的ph值调节至3.5-4.8，向反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，所得过滤清液为待纯化液；
8、在一个实施方案中，步骤一为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的ph值调节至2.5-3.0，加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的ph值调节至3.5-4.8，得到待纯化液；
9、将反应液的ph值先调至2.5至3.0，可以在酸性条件下使蛋白变性析出，提高除杂效果。
10、在一个实施方案中，步骤一中使用盐酸和/或naoh调节ph值。
11、在一个实施方案中，步骤一所述吸附剂选自活性炭。
12、在一个实施方案中，步骤二中所用的纯水为2-4倍柱体积；
13、在一个实施方案中，步骤二中使用乙醇溶液洗脱产品；
14、在一个实施方案中，步骤二中使用30-70％的乙醇溶液洗脱产品；
15、在一个实施方案中，步骤三中，纯化洗脱液步骤包括纳滤、结晶。
16、在一个实施方案中，步骤三中，结晶溶剂为乙醇。
17、与现有技术相比，本专利技术提供的一种酶催化合成的β-烟酰胺单核苷酸的纯化工艺，通过调节溶液的ph，使产品和杂质的电离状态不同，经大孔吸附树脂吸附产品，用水洗脱不被树脂吸附的杂质和无机盐，再用乙醇溶液洗脱产品，以很高收率得到纯化的nmn溶液。吸附和洗脱条件温和，避免了离子交换树脂洗脱时的强酸造成产品分解的风险，保证产品的提纯效果，步骤简单，杂质去除效果好，烟酸单核苷酸杂质可控制在0.1％以下。本专利技术制得的β-烟酰胺单核苷酸的纯度≥99.8％，收率超过80％。
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1.一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液为：以D-核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸ATP、多聚磷酸盐为原料，在磷酸核糖焦磷酸合成酶、核糖激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的共同催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸得到的反应液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为：向含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液，或者为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5-4.8，向反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，所得过滤清液为待纯化液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至2.5-3.0，加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤一中使用盐酸和/或NaOH调节pH值。
6.如权利要
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所用的纯水为2-4倍柱体积。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中使用乙醇溶液洗脱产品。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，纯化洗脱液步骤包括纳滤、结晶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤三中，结晶溶剂为乙醇。
...【技术特征摘要】
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液为：以d-核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸atp、多聚磷酸盐为原料，在磷酸核糖焦磷酸合成酶、核糖激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的共同催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸得到的反应液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为：向含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的ph值调节至3.5-4.8，得到待纯化液，或者为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的ph值调节至3.5-4.8，向反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，所得过滤清液为待纯化液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢新开，黄晓飞，邹丽，
申请(专利权)人：苏州引航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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