经突变修饰的烟酰胺磷酸核糖转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种来源于曼氏杆菌

【技术实现步骤摘要】
经突变修饰的烟酰胺磷酸核糖转移酶及其应用


[0001]本专利技术属于人工修饰酶蛋白领域，具体涉及对烟酰胺磷酸核糖转移酶的突变修饰，以及突变体用于
β
‑
烟酰胺单核苷酸的酶催化合成的应用
。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸
(
β
‑
NMN)
，在人体内通过转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(NAD
+
)
发挥作用
。NAD
+
(
又称辅酶
I)
，是人体内重要的辅酶，存在于所有活细胞中，对调节细胞衰老和维持机体正常功能起到至关重要的作用
。
衰老过程中
NAD
+
的下降被认为是导致疾病和残疾的主要原因之一，如听力和视力丧失，认知和运动功能障碍，免疫缺陷，自身免疫炎症反应失调导致的关节炎
、
代谢障碍和心血管疾病
。
因此，补充
β
‑
NMN
可以提高体内
NAD
+
含量，从而延缓
、
改善
、
防止衰老相关的多种表型，或年龄诱导的代谢紊乱
、
老年疾病等
。
[0003]目前
β
‑
NMN
合成方法主要有化学法和酶法，化学法合成
β
‑
NMN
成本高，对环境污染大，而目前酶法合成主要以烟酰胺核糖为原料合成，底物成本较高
。
利用
D
‑
核糖为原料酶法合成
β
‑
NMN
受限于烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活性较低，酶用量较大，导致成本较高，无法产业化
。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种来源于曼氏杆菌
Mannheimia sp.
的烟酰胺磷酸核糖转移酶
(NAMPRT)
及其突变体，以及所述突变体用于
β
‑
NMN
的酶催化合成的应用
。
[0005]本专利技术所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其为将
SEQ ID No.2
所述的氨基酸序列进行选自
S243G
，
I244H
，
P245A
或
S247T
的单位点突变，或者选自上述位点的双位点
、
三位点或四位点突变获得的突变体
。
[0006]优选的，所述双位点突变为
I244H、P245A
双位点突变
。
[0007]优选的，所述三位点突变为
I244H、P245A、S247T
三位点突变
。
[0008]本专利技术中所述的各突变体的编码基因也属于本专利技术的保护范畴之内
。
[0009]本专利技术的另一方面提供含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体
。
[0010]本专利技术另一方面提供所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于
β
‑
NMN
的酶催化合成的应用
。
[0011]本专利技术另一方面提供一种于
β
‑
NMN
的酶催化合成方法，其包括如下步骤：
[0012]步骤一：将
D
‑
核糖利用核糖激酶磷催化酸化得到
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸；
[0013]步骤二：将
D
‑
核糖
‑5‑
磷酸用磷酸核糖焦磷酸合成酶催化，得到5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸；
[0014]步骤三：将5‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸用本专利技术的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体催化，得到
β
‑
NMN。
[0015]优选的，第三步还包括添加焦磷酸酶水解副产物焦磷酸
。
[0016]优选的，酶催化反应的
ATP
再生体系为：腺苷酸激酶和多聚磷酸激酶利用六偏磷酸钠再生
。
[0017]优选的，上述三步反应及
ATP
再生在一锅中反应
。
[0018]本专利技术的烟酰胺磷酸核糖转移酶
(NAMPRT)
突变体的构建是通过同源建模得到蛋白三维结构，与底物进行分子对接后得到酶
‑
底物复合体结构，根据底物附近的氨基酸残基进行位点选择，利用本领域技术人员通常已知的定向进化技术从该质粒构建体产生基因变体文库
(Methods for the directed evolution of proteins.Nat Rev Genet,2015,16(7):379
–
394)
，并进行酶活性筛选得到优势突变体
。
附图说明
[0019]图1：本专利技术
β
‑
NMN
的酶催化合成方法流程图
具体实施方式
[0020]本专利技术可通过以下具体实施方案来实现，但本专利技术并不限于以下实施例
。
[0021]实施例1：基因克隆和表达载体的构建
[0022]野生型的烟酰胺磷酸核糖转移酶
(NAMPRT)(
来自曼氏杆菌
(Mannheimia sp.)
，
SEQ ID No.2)、
磷酸核糖焦磷酸合成酶
(PRS
，来自热泉热棒菌
(Pyrobaculum calidifontis)
，
SEQ ID No.12)、
核糖激酶
(RK
，来自大肠杆菌
(Escherichia coli)
，
SEQ ID No.14)、
焦磷酸水解酶
(PPA
，
SEQ ID No.16)、
腺苷酸激酶
(AK
，来自不动杆菌
(Acinetobacter johnsonii)
，
SEQ ID No.18)
和多聚磷酸激酶
(PPK
，来自不动杆菌
(Acinetobacter johnsonii)
，
SEQ ID No.20)
的氨基酸序列可以在
NCBI
数据库中获得，通过基因合成和普通的分子克隆手段可以构建含有目的基因的
pET30a
表达质粒，其中
NAMPRT
的核酸序列为
SEQ ID No.1
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，所述突变体为将
SEQ ID No.2
所述的氨基酸序列进行选自
S243G
，
I244H
，
P245A
或
S247T
的单位点突变，或者选自上述位点的双位点
、
三位点或四位点突变获得的突变体
。2.
如权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，所述双位点突变为
I244H、P245A
双位点突变，所述三位点突变为
I244H、P245A、S247T
三位点突变
。3.
权利要求1或2所述的突变体的编码基因
。4.
含有权利要求3所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞
。5.
权利要求4所述的的重组表达载体，其为重组原核表达载体或重组真核载体
。6.
权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于
β
‑
NMN
的酶催化合成的应用
。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢新开，梁晓亮，杜好勉，
申请(专利权)人：苏州引航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：