【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其是涉及用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒和应用。
技术介绍
1、滚环扩增技术(rolling circle amplification，rca)与超分支滚环扩增技术(hyperbranchedrollingcycleamplification,hrca)是一种有效的酶促等温反应，它以闭环的环状核苷酸为模板，在短dna或rna引物的结合作用下，产生长串联的单链dna或rna产物。作为合成环状核酸分子(如质粒)副本的自然滚环复制的简化衍生物，rca无需热循环即可快速扩增环状模板，并在分子生物学中找到了各种应用。与其他扩增策略相比，rca有以下几个优点：首先，由于连接挂锁探针需要严格的互补性，因此它赋予了rca反应高度的特异性，甚至可以用来区分单个碱基的错配。其次，通过引入多种引物，指数放大很容易实现，因此也有具备良好的灵敏度。第三，可以通过操作圆形模板来定制rca产品，以生成功能性核酸，例如适体，dna酶和限制酶位点。此外，rca具有良好的生物相容性，尤其适用于原位检测。因此，rca作为一种高效且潜在的工具，可以高度敏感地检测生物标志物，引起了广泛的关注。并且，更加适合检测具有未知结构变异的序列。
2、虽然滚环扩增技术(rolling circle amplification，rca)与超分支滚环扩增技术(hyperbranchedrollingcycleamplification，hrca)在原位检测以及测序上有着很好的应用场景。但其最大的问题就在于必须以环状dna/rna作为开端进行扩增检测
技术实现思路
1、本专利技术核心聚焦在如何借鉴超分支滚环扩增技术与滚环扩增技术的工作原理，创新性地提出一种可以提升效率或能解决上述问题的新一代滚环扩增办法。
2、本专利技术提供了用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒，包括前端向导dna、后端向导dna、模板连接引物、tth argonaute核酸内切酶和dna连接酶，
3、所述前端向导dna和所述后端向导dna为单链dna且5’端磷酸化，所述前端向导dna特异性结合所述待测核酸5’端相邻片段和所述待测核酸5’端片段，所述后端向导dna特异性结合所述待测核酸3’端相邻片段和所述待测核酸3’端片段，所述前端向导dna和后端向导dna用于指导tth argonaute核酸内切酶将包含待测核酸的核酸分子切割为含有待测核酸的单链核酸；
4、所述模板连接引物为单链dna，其从5’端-3’端依次包括：与含有待测核酸的单链核酸的3’端至少6nt区域反向互补的区域和与含有待测核酸的单链核酸的5’端至少6nt区域互补的区域；
5、所述dna连接酶用于将开口环状dna连接形成闭口环状dna。
6、该试剂盒的技术核心将一种名为“tth argonaute”的特殊核酸内切酶，配合滚环扩增技术、超分支滚环扩增技术的工作原理，从而实现核酸序列特异性的靶标切割再连接滚环扩增方法。首先，“tth argonaute”是一种可编辑的核酸内切酶，其通过在5‘端的磷酸化单链dna(16–18nt)指导下，可发挥dna介导的核酸内切酶作用，并在与dna向导链(即前端向导dna和/或后端向导dna)第10和11个碱基互补的碱基处切割底物核酸(即包含待测核酸的核酸分子)。通过使用多个上述核酸内切酶，能实现对底物核酸的特异性切割，并得到具有明确目的性的特异ssdna片段。其次，在模拟滚环扩增技术、超分支滚环扩增技术的工作原理，通过人工设计高度特异性的，并且与“tth argonaute”内切酶切割得到的特异ssdna片段5’/3’两端互补的模板连接引物，在连接酶的作用下，将内切酶切割得到的特异ssdna片段补齐成环。在聚合酶的作用下，模板连接引物在补齐成环的ssdna片段上开始从3’端聚合延伸，从而实现特异性的滚环线性扩增。更可以通过设计一条或多条与扩增产物互补的反向引物，实现特异性的滚环指数级扩增。
7、图1为tth argonaute核酸内切酶对底物核酸的切割与开口环状dna的制备。tthargonaute核酸内切酶与前端/后端向导dna孵育后产生的复合物(ttago angonaute&5’pssdna complex)，在特异的10～11nt处酶切底物核酸(ds dna nucleic acid substrate或ssdna nucleic acid substrate)，切割后的产物(cut product，即target nucleic acidsubstrate)被模板结合引物(template ligation primer)捕获并折叠，形成开口状环状dna。
8、图2为开口环状dna的环化与滚环扩增。开口环状dna在taq dna连接酶的作用下进行连接，形成闭口环状dna。滚环扩增以闭口环状dna为扩增模板，在bst聚合酶、dntps等离子的作用下，采用正向扩增引物完成滚环的线性扩增(linear amplification)，或者采用正向扩增引物和反向扩增，完成滚环的指数扩增(exponential amplification)。
9、包含待测核酸的核酸分子可为dsdna，也可以是ssdna。“tth argonaute”核酸内切酶切割核酸分子时，可以使用复数个5’磷酸化修饰的单链dna作为向导，具体的“tthargonaute”核酸内切酶切割核酸分子时，优先选择2个5’磷酸化修饰的单链dna作为向导切割核酸分子。
10、可选地，根据上述的试剂盒，所述模板连接引物的长度≥12nt。例如，模板连接引物的长度可以为12nt～50nt，例如可为12nt～20nt、21nt～30nt、31nt～40nt或41nt～50nt。
11、在一个实施例中，人工设计的模板连接引物应与“tth argonaute”内切酶切割得到的特异ssdna片段发生结合，且结合位置为ssdna的3’端与模板连接引物的5’端结合，ssdna的5’端与模板连接引物的3’端结合，形成开口环状dna。开口环状dna可以通过各种dna连接酶进行连接，形成闭环环状dna。
12、可选地，根据上述的试剂盒，还包括正向扩增引物，所述正向扩增引物与部分所述待测核酸反向互补，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒，其特征在于：包括前端向导DNA、后端向导DNA、模板连接引物、Tth argonaute核酸内切酶和DNA连接酶，
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述模板连接引物的长度≥12nt。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：包括正向扩增引物，所述正向扩增引物与部分所述待测核酸反向互补，用于扩增所述待测核酸。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：包括反向扩增引物，所述反向扩增引物与部分所述待测核酸相同，用于扩增所述待测核酸。
5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：包括检测分子信标，所述检测分子信标为与目标核酸特异性结合的单链DNA，所述检测分子信标两端分别连接荧光基团和淬灭基团。
6.权利要求1-5任一所述试剂盒在如下任一种的应用：
7.待测核酸的环化方法，其特征在于：包括
8.待测核酸的扩增方法，其特征在于：为M1或M2，
9.待测核酸的检测方法，其特征在于：包括
【技术特征摘要】
1.用于待测核酸环化或扩增或检测的试剂盒，其特征在于：包括前端向导dna、后端向导dna、模板连接引物、tth argonaute核酸内切酶和dna连接酶，
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述模板连接引物的长度≥12nt。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：包括正向扩增引物，所述正向扩增引物与部分所述待测核酸反向互补，用于扩增所述待测核酸。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：包括反向扩增引物，所述反向...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈燕旌，张岩，边素莹，张诚，董镇赫，李光辉，周志雄，
申请(专利权)人：首都体育学院，
类型：发明
国别省市：
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