【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于在使用了被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中使用的细胞剥离剂等。
技术介绍
1、在再生医疗领域中，多使用从患有疾病的患者中提取出正常细胞，在体外培养后，再度移植至患者的手法。但是，难以从患者体内、血液、体液中仅取出特定的细胞。因此需要一种分离特定细胞的技术。
2、该细胞分离方法也普及于病理诊断或临床检查的领域中。作为细胞分离方法，已知密度梯度离心法、使用磁性粒子的分离法、使用基材的分离方法或组合流式细胞仪和细胞分选仪的方法。其中，使用磁性粒子的分离法是一种可处理的细胞数较多、分离后的细胞纯度也较高的手法。
3、在使用通常的磁性粒子的细胞分离方法中，利用脱硫生物素-链霉亲和素(streptavidin)的相互作用的方法为通常方法。首先，将被分离细胞的特异性抗体进行脱硫生物素化。在使该脱硫生物素化抗体和被分离细胞的表面抗原进行反应后，使用表面上具有链霉亲和素的磁性粒子进行捕捉。其为一种在通过磁力收集磁性粒子，从含有多种细胞的细胞群中分离被分离细胞后，作为细胞剥离剂，添加大量的生物素，通过使其与脱硫生物素-链霉亲和素之间的相互作用进行竞合，将被分离细胞和磁性粒子进行脱离的手法。然而，由于需要使用大量的生物素使细胞从分离载体(carrier)脱离，因此，需要多次清洗分离后的细胞，存在需要长时间作业的问题。
4、作为不使用生物素的细胞分离方法，专利文献1中公开了一种凭借右旋糖酐(dextran)的酶分解性的连接子(linker)使分离载体-细胞间结合，通过使用酶切断连接子从而使细胞
5、作为不使用大量的生物素、酶的细胞分离方法，专利文献2中作为特异性分离t细胞的方法公开了使用strep-tag化的mhc多聚体的细胞分离方法。是一种使与t细胞的表面抗原结合的strep-tag化mhc多聚体和具有strep-tactin的磁性粒子结合后，进行被分离细胞的分类，之后，作为细胞剥离剂，通过少量的生物素将被分离细胞脱离的方法。该细胞分离方法对细胞的伤害较少，但使用的strep-tag化mhc多聚体可能仅对应于t细胞，不适用于其他种类的细胞，存在通用性较低的问题。
6、现有技术文献
7、专利文献
8、专利文献1：日本特开2016-136937号公报
9、专利文献2：日本特开2017-514481号公报
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、如上所述，在使用被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中，还未知晓一种能适用于种类广泛的细胞、且进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂。
3、本专利技术的问题是提供一种在使用被分离细胞的表面抗原的细胞分离方法中，能适用于种类广泛的细胞、且进一步地无需在分离后清洗被分离细胞的细胞剥离剂以及使用该细胞剥离剂的细胞分离方法。
4、用以解决问题的手段
5、本专利技术人为了达成上述目的进行了多次深入研究，结果发现：作为使被分离细胞从分离载体脱离的驱动力，可利用温度应答引起的聚合物链的伸缩、含有对分离后的细胞不造成影响的聚合物的细胞剥离剂能够解决上述问题。
6、即，本专利技术至少提供下述的[1]～[22]。
7、[1]一种细胞剥离剂，
8、其为用于从与被分离细胞结合的分离载体剥离被分离细胞的细胞剥离剂，
9、所述细胞剥离剂包含含有结合性脲基的聚合物，所述含有结合性脲基的聚合物具有下述式(1)所示的侧链结构，在其侧链或末端具有可与上述分离载体结合的分离载体结合部位；
10、所述含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度(ucst)在4～40℃的范围。
11、[化1]
12、-nh-(c＝o)-nh2…(1)
13、[2]根据[1]所述的细胞剥离剂，所述分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
14、[3]根据[1]或[2]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
15、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列a，所述含有脲基的重复序列a为下述式(2)所示的含有脲基结构的重复。
16、[化2]
17、
18、(所述式(2)中，r1表示氢原子或甲基，a1表示o或nh，a表示1～6的整数。)
19、[5]根据[4]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物进一步含有亲水性重复序列b，所述亲水性重复序列b为下述式(3)所示的亲水性结构的重复。
20、[化3]
21、
22、(所述式(3)中，r2表示氢原子或甲基，a2表示o或nh，b表示1～6的整数，x从下述式(4)～(9)中进行选择。)
23、[化4]
24、
25、(所述式(9)中，m表示0～20的整数。)
26、[6]根据[5]所述的细胞剥离剂，在所述含有脲基的重复序列a中，a1为o，a为2；在所述亲水性重复序列b中，a2为o，b为2，x为上述式(4)所示。
27、[7]根据[5]或[6]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列a与上述亲水性重复序列b的摩尔比具有0.5≦a/(a+b)的关系。
28、[8]根据[4]～[7]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有结合性脲基的聚合物在所述含有脲基的聚合物的末端具有作为所述分离载体结合部位的生物素残基。
29、[9]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列c和亲水性重复序列d，所述含有脲基的重复序列c为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列d为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
30、[化5]
31、
32、[10]根据[9]所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列c和所述亲水性重复序列d的摩尔比具有0.5≦c/(c+d)的关系。
33、[11]根据[9]或[10]所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
34、[12]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列e和亲水性重复序列f，所述含有脲基的重复序列e为下述式(12)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列f为下述式(13)所示的亲水性结构的重复。
35、[化6]
36、
37、(所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞剥离剂，
2.根据权利要求1所述的细胞剥离剂，所述分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
4.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列A，所述含有脲基的重复序列A为下述式(2)所示含有脲基结构的重复，
5.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物进一步含有亲水性重复序列B，所述亲水性重复序列B为下述式(3)所示亲水性结构的重复，
6.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，在所述含有脲基的重复序列A中，A1为O，a为2；在所述亲水性重复序列B中，A2为O，b为2，X为所述式(4)所示。
7.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列A与所述亲水性重复序列B的摩尔比具有0.5≦A/(A+B)的关系。
8.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有结合
9.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列C和亲水性重复序列D，所述含有脲基的重复序列C为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列D为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
10.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列C和所述亲水性重复序列D的摩尔比具有0.5≦C/(C+D)的关系。
11.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
12.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列E和亲水性重复序列F，所述含有脲基的重复序列E为下述式(12)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列F为下述式(13)所示的亲水性结构的重复，
13.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的重复序列E中，c为0，d为3；所述亲水性重复序列F中，e为0，f为3。
14.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列E和所述亲水性重复序列F的摩尔比具有0.5≦E/(E+F)的关系。
15.根据权利要求12所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位的所述含有结合性脲基的聚合物。
16.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的数均分子量为20,000～1,000,000。
17.一种细胞分离方法，其特征在于，
18.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序A中，分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
19.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序A中，抗原识别物质为抗体、抗体片段、肽、核酸适配体、蛋白质A或凝集素。
20.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序B中，分离载体为磁性粒子。
21.根据权利要求20所述的细胞分离方法，所述工序C中，通过磁力从包含被分离细胞的细胞群中仅分离出被分离细胞-分离载体复合体。
22.根据权利要求17所述的细胞分离方法，所述工序D中，温度变化为在从含有结合性脲基的聚合物的上限临界溶液温度以下的温度加温至上限临界溶液温度以上的温度。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞剥离剂，
2.根据权利要求1所述的细胞剥离剂，所述分离载体结合部位为生物素残基、链霉亲和素残基、氨基、羧基、巯基、环糊精残基、金刚烷基或苯硼酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的主链为乙烯性不饱和聚合物、聚烯丙基胺或多肽。
4.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列a，所述含有脲基的重复序列a为下述式(2)所示含有脲基结构的重复，
5.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物进一步含有亲水性重复序列b，所述亲水性重复序列b为下述式(3)所示亲水性结构的重复，
6.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，在所述含有脲基的重复序列a中，a1为o，a为2；在所述亲水性重复序列b中，a2为o，b为2，x为所述式(4)所示。
7.根据权利要求5所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列a与所述亲水性重复序列b的摩尔比具有0.5≦a/(a+b)的关系。
8.根据权利要求4所述的细胞剥离剂，所述含有结合性脲基的聚合物在所述含有脲基的聚合物的末端具有作为所述分离载体结合部位的生物素残基。
9.根据权利要求1或2所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物具有含有脲基的重复序列c和亲水性重复序列d，所述含有脲基的重复序列c为下述式(10)所示的含有脲基结构的重复，所述亲水性重复序列d为下述式(11)所示的亲水性结构的重复。
10.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，所述含有脲基的聚合物的所述含有脲基的重复序列c和所述亲水性重复序列d的摩尔比具有0.5≦c/(c+d)的关系。
11.根据权利要求9所述的细胞剥离剂，包含在所述含有脲基的聚合物的侧链上具有生物素残基作为所述分离载体结合部位...
【专利技术属性】
技术研发人员：今村龙太郎，大岳知之，丸山厚，嶋田直彦，
申请(专利权)人：日油株式会社，
类型：发明
国别省市：
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