【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因组原位杂交方法，具体而言属于一种石蒜基因组探针制备及其基因组原位杂交方法。
技术介绍
1、染色体原位杂交技术是一项利用标记后的己知序列的 dna 或 rna 探针直接在组织切片上与核酸进行杂交，定位特定靶基因序列的分子细胞遗传学技术。通过探针与靶dna的结合产生的荧光信号位点进行染色体的准确识别，主要包括荧光原位杂交和基因组原位杂交两种，其中荧光原位杂交技术（fish）主要采用的探针是克隆的 rdna 和其他主要的串联重复序列，根据杂交信号的位置和数量识别染色体的核型和倍性。目前已有研究表明，通过fish获取的石蒜属植物信号位点在染色体上的分布，识别染色体结构变异， rdna在染色体上的定位，构建rrna 基因物理图谱。但已有的fish技术还无法区分杂交后代的亲本染色体，也无法直接鉴定杂交种的亲本。
2、基因组原位杂交技术(gish)是以植物的总基因组 dna为探针，与杂交种的染色体杂交，达到鉴定杂交种的亲本，识别染色体重组片段并探明异源多倍体的来源。gish技术简便易行，不用分离探针，只需提取植物总基因组 dna 进行标记作为探针，可与整条染色体杂交，且在细胞分裂的任何时期观察到杂交位点，迅速准确地进行目标染色体(片段)及基因组的检测。目前gish技术已广泛用于植物异源染色质的鉴定及物种起源演化研究，并有效识别出百合、水仙杂种后代染色体。但gish技术在石蒜属杂交种亲本染色体识别、种间关系鉴定和杂交种的遗传组成方面的研究工作进展缓慢，主要原因为石蒜以自然杂交种为主，在不清楚杂交种亲本的情况下，很难
3、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种石蒜基因组探针的制备方法，通过对探针来源的筛选以及制备条件的改变，使得该种制备方法制得的探针，可以提高杂交的成功率和可识别的特异性。
2、本专利技术的第二目的在于提供上述石蒜基因组原位杂交方法中所制备的探针的原位基因组的杂交方法，通过对封阻dna的筛选、杂交过程中反应条件的改变，保证基因组原位杂交技术的特异性，提高gish技术的成功率。
3、为实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
4、一种石蒜基因组探针的制备方法，包括如下步骤：
5、将具有mt核型或aa核型染色体的植物总基因组dna与水、生物素标记缺口转录混合物混合均匀，加热，充分反应后，即得；所述dna:水:生物素标记缺口转录混合物的体积比=1:15:4。
6、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述mt 核型染色体的植物总基因组dna的来源为中国石蒜或忽地笑；所述aa核型染色体的植物总基因组dna的来源为换锦花。
7、一种上述石蒜基因组探针的制备方法所制备的探针。
8、本专利技术中所选择mt核型染色体或aa核型染色体作为探针的材料。石蒜核型可分为a、mt和mt-a三种，且石蒜属植物种间染色体同源性较高，导致在gish的应用中，杂交特异性低，杂交信号不明显。而本专利技术中使用mt或aa核型染色体作为材料，当有mt核型和a核型的亲本杂交时候，用mt核型作为探针杂交更容易识别，该种核型的染色体长度较长，与其他种亲缘关系较远，因此在杂交过程中可以排除其他同源染色体的干扰，使杂交信号在染色体上更容易识别，信号更加清晰可见。除此以外，dna:水:生物素标记缺口转录混合物=1:15:4的比例进行混合后，能够最大限度的增加杂交信号的信号值，保证了gish技术的成功率。
9、一种使用上述石蒜基因组探针制备的方法制备的探针所进行的石蒜基因组原位杂交方法，包括如下步骤：
10、染色体玻片标本的制备和预处理、封阻dna的制备、染色体和所述探针和封阻dna的共变性、杂交以及松紧度洗涤与信号检测。
11、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述染色体玻片标本的制备和预处理包括如下步骤：
12、取石蒜种球幼根，加入放线菌酮处理，随后固定；
13、将固定好的根尖加入体积比为1%的混合液，酶解处理；
14、将酶解好的根尖加热，压片，随后二次固定。
15、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述封阻dna为鲱鱼精子dna。
16、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述二次固定步骤中需要加入体积比为4%的多聚甲醛固定10min-12min。
17、优选地，作为进一步具体的实施方式，所述酶解时间为40min-90min。
18、本专利技术提供的基因组原位杂交方法可以以石蒜属植物种间杂交后代的有丝分裂中期的染色体为待测靶标，以一个亲本物种的全基因组 dna 为探针 dna，进行基因组原位杂交。石蒜属植物种间杂交，包括（近缘杂交和远缘杂交）染色体同源性较高，封阻dna很难通过杂交封闭种的非特异性杂交位点，其中以另一个亲本物种的全基因组dna为封阻dna，很难区分种间特异性。现有技术中对于野生种无法选择适合的封阻dna，所使用的封阻dna多用于与探针配合鉴别杂交种。
19、本专利技术中的鲱鱼精子dna作为封阻dna需要与所制备的探针配合使用，排除了亲缘关系较近的同源染色体的干扰，也可以更好的识别野生种，故采取统一的鲱鱼精子 dna 作为封阻 dna，采用鲱鱼精子 dna 做到了简单、便捷和容易区分。
20、同时，通过对染色体玻片标本的制备和预处理条件的调整，加强染色体与探针dna和封阻dna充分杂交，提高杂交的成功率和可识别的特异性。通过加体积比为4%的多聚甲醛常温下固定10min-12min，可以保证染色体在洗脱过程中不被洗脱，避免因为染色体被洗脱后浓度过低，降低gish成功率的可能性。
21、在染色体玻片标本的制备和预处理条件过程中，以果胶酶和纤维素酶体积比1:1进行混合，制备出混合液，以及将酶解时间控制在40min-90min，可以使得石蒜组织间的果胶质充分分解，细胞壁软化部分分解，使细胞和染色体更容易分散压平，同时防止酶解时间过长而导致的细胞膜过早破裂，导致染色体丢失，影响信号值，更利于后续实验。
22、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
23、（1）保证基因组原位杂交技术的特异性，提供 gish 技术的成功率。
24、（2）本专利技术通过基因组原位杂交的条件参数进行全面的优化与调整，保证了石蒜基因组原位杂交方法的成功率，利用本专利技术提供的方法进行石蒜基因组原位杂交，杂交特异性更加便捷区分，杂交信号在染色体上更清晰可见，杂交种亲本染色体更容易辨识，为石蒜的种质鉴定及杂交育种的遗传分析在实践应用中提供可能。
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1.一种石蒜基因组探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述石蒜基因组探针的制备方法，其特征在于，所述MT 核型染色体的植物总基因组DNA的来源为中国石蒜或忽地笑；所述AA核型染色体的植物总基因组DNA的来源为换锦花。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的石蒜基因组探针的制备方法制备的探针。
4.采用权利要求3所述探针所进行的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，所述染色体玻片标本的制备和预处理，包括如下步骤：
6.根据权利要求4所述的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，所述封阻DNA为鲱鱼精子DNA。
7.根据权利要求5所述的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，所述二次固定步骤中需要加入体积比为4%的多聚甲醛固定10min-12min。
8.根据权利要求5所述的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，所述酶解时间为40min-90min。
【技术特征摘要】
1.一种石蒜基因组探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述石蒜基因组探针的制备方法，其特征在于，所述mt 核型染色体的植物总基因组dna的来源为中国石蒜或忽地笑；所述aa核型染色体的植物总基因组dna的来源为换锦花。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的石蒜基因组探针的制备方法制备的探针。
4.采用权利要求3所述探针所进行的石蒜基因组的原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：张露，张悦，周树军，刘思羽，尹丹，孙艳妮，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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