一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括：珍珠粉标准指纹图谱的建立、待测珍珠粉指纹图谱的测定和结果判定等步骤；采用本发明专利技术方法对珍珠粉进行分析鉴定，速度快、灵敏度高，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。(二)
技术介绍
珍珠粉及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能 提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以 解决这一问题，建立珍珠粉指纹图谱将能较为全面地反映珍珠粉及其制剂中所含化学成分 的种类与数量，进而对质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果能进一步开展谱效学研 究，可使珍珠粉质量与其药效真正结合起来，有助于阐明珍珠粉作用机理。总之，研究和建 立珍珠粉的指纹图谱，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依 据。 目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外 光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为 主流方法，尤其是HPLC、 TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离 效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在 高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验，因此本专利技术首选高效液相色 谱法作为珍珠粉指纹图谱的分析手段。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供。 本专利技术采用的技术方案是 —种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括 (1)珍珠粉标准指纹图谱的建立 ①珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉250 750mg，于10 20ml耐 温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸1 10ml，加盖密封，置于80°C 120。C下，水解12 36 小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶 中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的 三乙胺乙腈溶液、体积浓度1. 25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶 液10ul，加盖，混匀，置于28°C ±0. 5°C下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置 10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液； ②参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0. lmol/L盐酸溶 液使溶解，制成浓度为lmg/ml的内标液； ③色谱条件采用Ve皿sil-AA分析柱(4. 6mmX 250mm， 5iim)，以用醋酸调节 至pH = 6. 50的0. 1M的醋酸钠水溶液为流动相A(该流动相温度与室温平衡时，应保持 26°C ±2°C )，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm ;柱温45。C;体积流量为lml/min ;理论板数按正亮氨酸峰计算应不得低于1. 1X105。测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液，注入液相色谱仪，照高 效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱所述珍珠粉标准指纹图谱中，共有9个特征 峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0. 25，0. 29， 0. 26 0. 32 ;2#峰:0. 28， 0. 10， 0. 09 0. 12 ;3#峰:0. 42， 0. 32， 0. 28 0. 35 ;4#峰:0. 44， 0. 99，0. 90 1. 1 ;5#峰0. 52， 0. 13， 0. 12 0. 14 ;6#峰0. 59， 1， 1 ;7#峰0. 94， 0. 22， 0. 21 0. 24 ;8#峰:1. ll，O. 14，0. 13 0. 15 ;9#峰:1. 21，0. 18，0. 17 0. 20 ; 相对保留时间标的个峰的出峰保留时间与内标物正亮氨酸出峰保留时间的比 值。相对峰面积标的个峰的面积与Ala丙氨酸(图示6#峰，相对保留时间0. 59)峰面积的比值。(2)按照步骤(1)相同方法测定待测珍珠粉指纹图谱； (3)将待测珍珠粉指纹图谱与珍珠粉标准指纹图谱进行比对，按照下述标准进行 判定 ①峰貌判定1 9#特征峰缺失数量不得多于1个，且1 9#特征峰的峰大小关 系应符合4#峰或6#峰> 1#峰或3#峰> 7#峰或9#峰> 8#峰或5#峰或2#峰，不满足 上述条件为非珍珠粉； ②相对峰面积指纹特征判定当样品有个峰的相对峰面积超出上下限10%为非 珍珠粉； ③以均值为标准对照组，通过Excel软件函数C0RREL计算样品组与标准对照组的 相关系数；相关系数不小于0. 996为珍珠粉，小于0. 996为非珍珠粉。 所述步骤(1)第③步中梯度洗脱步骤各时间段流动相A和流动相B体积含量变化如下表所示<table>table see original document page 5</column></row><table> 本专利技术的有益效果主要体现在采用本专利技术方法对珍珠粉进行分析鉴定，速度快、 灵敏度高，为珍珠粉的鉴别和品质评价、质量控制、制定质量标准提供了重要依据。(四) 附图说明 图1为珍珠粉标准指纹图谱。(五) 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于 此 实施例1 :珍珠粉标准指纹图谱的建立 (1)珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉500mg，于15ml耐温耐压瓶中， 准确加入6M的盐酸5ml，加盖密封，置于ll(TC下，水解24小时；取出，放冷，开瓶，将水解液 移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，用孔径为0. 45微米 的微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14%的三乙胺乙腈溶 液(乙腈为溶剂)、体积浓度1.25%的异硫氰酸苯酯乙腈溶液(乙腈为溶剂)各50ul，再 加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28°C ±0. 5t:下衍生90分钟，取出，加正己烷 400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液； (2)参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0. lmol/L盐酸 溶液使溶解，制成浓度为lmg/ml的内标液； (3)色谱条件采用Ve皿sil-AA分析柱(4. 6mmX 250mm， 5 y m)，以用醋酸调节 至pH = 6. 50的0. 1M的醋酸钠水溶液为流动相A(该流动相温度与室温平衡时，应保持 26°C ±2°C )，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为254nm ;柱温45。C;体积 流量为lml/min ;理论板数按正亮氨酸峰计算应不得低于1. 1X105 : <table>table see original document page 6</column></row><table> (4)测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液2 L，注入液相色谱 仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱 所述珍珠粉标准指纹图谱(见图1)中，共有9个特征峰，各特征峰对应的相对保 留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0. 25，0. 29，0. 26 0. 32 ;2#峰0. 28，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括：　　　　（１）珍珠粉标准指纹图谱的建立：　　　　①珍珠粉标准品溶液的配制：精密称取纯珍珠粉２５０～７５０ｍｇ，于１０～２０ｍｌ耐温耐压瓶中，准确加入６Ｍ的盐酸１～１０ｍｌ，加盖密封，置于８０℃～１２０℃下，水解１２～３６小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入１０ｍｌ量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液１００ｕｌ至２ｍｌ小瓶中，依次准确加入体积浓度１４％的三乙胺乙腈溶液、体积浓度１．２５％的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各５０ｕｌ，再加正亮氨酸内标溶液１０ｕｌ，加盖，混匀，置于２８℃±０．５℃下衍生９０分钟，取出，加正己烷４００ｕｌ，振摇，静置１０ｍｉｎ，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液；　　　　②参照物正亮氨酸内标溶液的制备：准确称取正亮氨酸适量，加０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液使溶解，制成浓度为１ｍｇ／ｍｌ的内标液；　　　　③色谱条件：采用Ｖｅｎｕｓｉｌ－ＡＡ分析柱，以用醋酸调节至ｐＨ＝６．５０的０．１Ｍ的醋酸钠水溶液为流动相Ａ，以乙腈为流动相Ｂ，进行梯度洗脱；检测波长为２５４ｎｍ；柱温４５℃；体积流量为１ｍｌ／ｍｉｎ；　　　　④测定：精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱：所述珍珠粉标准指纹图谱中，共有９个特征峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下：１＃峰：０．２５，０．２９，０．２６～０．３２；２＃峰：０．２８，０．１０，０．０９～０．１２；３＃峰：０．４２，０．３２，０．２８～０．３５；４＃峰：０．４４，０．９９，０．９０～１．１；５＃峰：０．５２，０．１３，０．１２～０．１４；６＃峰：０．５９，１，１；７＃峰：０．９４，０．２２，０．２１～０．２４；８＃峰：１．１１，０．１４，０．１３～０．１５；９＃峰：１．２１，０．１８，０．１７～０．２０；　　　　（２）按照步骤（１）相同方法测定待测珍珠粉指纹图谱；　　　　（３）将待测珍珠粉指纹图谱与珍珠粉标准指纹图谱进行比对，按照下述标准进行判定：　　　　①峰貌判定：１～９＃特征峰缺失数量不得多于１个，且１～９＃特征峰的峰大小关系应符合：４＃峰或６＃峰＞１＃峰或３＃峰＞７＃峰或９＃峰＞８＃峰或５＃峰或２＃峰，不满足上述条件为非珍珠粉；　　　　②相对峰面积指纹特征判定：当样品有个峰的相对峰面积超出上下...

【技术特征摘要】
一种珍珠粉的高效液相指纹图谱鉴定方法，所述方法包括(1)珍珠粉标准指纹图谱的建立①珍珠粉标准品溶液的配制精密称取纯珍珠粉250～750mg，于10～20ml耐温耐压瓶中，准确加入6M的盐酸1～10ml，加盖密封，置于80℃～120℃下，水解12～36小时；取出，放冷，开瓶，将水解液移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣以水溶解，移入10ml量瓶中，定容，摇匀，微孔滤膜精滤，取滤液100ul至2ml小瓶中，依次准确加入体积浓度14％的三乙胺乙腈溶液、体积浓度1.25％的异硫氰酸苯酯乙腈溶液各50ul，再加正亮氨酸内标溶液10ul，加盖，混匀，置于28℃±0.5℃下衍生90分钟，取出，加正己烷400ul，振摇，静置10min，取下层溶液，即得珍珠粉标准品溶液；②参照物正亮氨酸内标溶液的制备准确称取正亮氨酸适量，加0.1mol/L盐酸溶液使溶解，制成浓度为1mg/ml的内标液；③色谱条件采用Venusil-AA分析柱，以用醋酸调节至pH＝6.50的0.1M的醋酸钠水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温45℃；体积流量为1ml/min；④测定精密吸取珍珠粉标准品溶液及正亮氨酸内标溶液，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，制定珍珠粉标准指纹图谱所述珍珠粉标准指纹图谱中，共有9个特征峰，各特征峰对应的相对保留时间、各峰相对峰面积的均值和区间如下1#峰0.25，0.29，0.26～0.32；2#峰0.28，0.10，0.09～0.12；3#峰0.42...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小龙，冯旭俊，谢乾程，
申请(专利权)人：浙江英格莱制药有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]