一种生物技术领域的ｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ２０抗原及其多克隆抗体的制备方法；本发明专利技术涉及的ｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ２０抗原的氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２所示；本发明专利技术还涉及一种分离核酸，其碱基序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１所示；本发明专利技术还涉及一种多克隆抗体，该多克隆抗体可用如下的方法制备得到，该方法包括如下步骤：以氨基酸序列如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：２所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；纯化抗血清，即得；本发明专利技术还涉及一种制备多克隆抗体的方法，包括如下步骤：克隆如ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１所示的核酸片段；构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得蛋白质；以所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。本发明专利技术的方法简单，制备的抗体免疫原性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
的抗体及其制备方法，具体是一种ppGalNAC-T20 抗原及其多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
UDP-半乳糖酰胺N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-Ts)是0_型糖蛋白糖链合成反应的第一步起始糖基转移酶，它能将N-乙酰氨基半乳糖基转移到蛋白质肽链的 丝氨酸或苏氨酸残基上。人体中的PPGalNAc-Ts家族中己有19个成员被报道研究，它们 在人体组织中的分布和对体外多肽底物的糖基化修饰的专一性上都存在着不同程度的差 异。ppGalNAc-Ts可作为肿瘤标志物，例如在神经母细胞瘤衍生细胞株中特异性高表达的 ppGalNAC-T13，它可以作为脊髓发生神经母细胞瘤的早期诊断标志。另外，ppGalNAc-T6 可以作为乳腺癌的免疫组化检测标志。最新研究结果表明，ppGalNAc-TH调控死亡受体 Apo2L/TRAIL的糖基化修饰，过表达ppGalNAc_T14能显著促进细胞的凋亡。ppGalNAc-Ts 除具有糖基转移酶功能之外，还具有潜在的重要临床诊断意义。因此，获得ppGalNAc-Ts家 族各个成员的抗体，对精确定位其在组织和细胞中的分布有着重要意义，从而更真实的反 映它们的生物学功能。然而ppGalNAc-Ts家族成员间的同源性较高，不同成员间的同源性 可达40% 70%，因此保证其抗体的特异性至关重要。ppGalNAc-Ts家族成员均为II型膜蛋白，N端有一个4 22个氨基酸的胞浆区， 继以一个15 25个氨基酸的穿膜区，通过一个长短不一的茎区与C端伸入高尔基体内大 约450个氨基酸的催化区相连接。ppGalNAC-T20从一级结构分析属于UDP-半乳糖酰胺 多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族成员，它与ppGalNac-TIO在氨基酸水平上具有70. 7% 的相似性。虽然只在脑和睾丸组织中检测到表达量较低的ppGalNAC-T20mRNA，但鉴于其存 在部位的特殊性，可以推测其在机体分化、发育过程中起着重要的调节作用。经对现有技术的文献检索发现，N Berois et al.等采用多肽合成的方法制 备 ppGalNAc-T13 抗体(N Berois et al. , ppGalNAc-T13 :A New Molecular Marker of BoneMarrow Involvement in Neuroblastoma, Clinical Chemistry,2006,52 :1701 1712)，该方法一般需要合成15个左右的肽段，这样比较容易保证抗体的特异性。但 是，由于多肽的分子量相对较小，免疫原性较差，得到抗体比较困难，通常需将其与 MAP(multipleantigenic peptide)或KLH(钥孔血蓝蛋白)偶联，但是这样提高了成本。一 般用来制备抗体的抗原肽需10 20mg，纯度85%以上，这种级别的多肽合成价格为120元 /氨基酸，偶联基团MAP的价格也在1000元以上，较低的免疫原性和高昂的成本，限制了合 成多肽用于抗体制备方法的应用。目前尚未有与PpGalNAc-T20抗体制备相关的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ppGalNAC-T20抗原及其 多克隆抗体的制备方法。本专利技术制备的抗体不和与PpGalNAc-T20具有最高同源性的ppGalNAc-T10发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交叉反应；本专利技术通 过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化; 本专利技术克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种ppGalNAC-T20抗原，该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。编码所述蛋白质的核酸的碱基序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术还涉及一种如上所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括 如下步骤步骤一，以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体 制备方法制备抗血清；步骤二，纯化抗血清，即得。本专利技术还涉及一种如上所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗体制备方法，包括 如下步骤步骤一，克隆如SEQ ID N0:1所示的核酸片段；步骤二，利用步骤一所得核酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂 解，纯化，得蛋白质；步骤三，以步骤二所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清， 纯化抗血清，即得。步骤一中，所述克隆，所用引物对具体为如SEQ ID NO :3所示的上游引物和SEQ IDN0:4所示的下游引物。步骤二中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。步骤二中，所述重组质粒使用的质粒为PGEX-5X-1。步骤二中，筛选所述重组质粒的过程为将构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5 a 中，使用含有100 u g/ml氨苄青霉素的LB平板，37°C下培养12h，挑取单菌落后摇菌，提取质 粒并测序，测序正确的即为所需重组质粒。步骤二中，所述培养具体为，1L培养基的组成为蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCllOg，余量为水；培养温度为37°C ；培养至大肠杆菌BL21 (DE3)的0D值为0. 8 1. 2。步骤二中，所述诱导为加入IPTG，使其终浓度为0. ImM 0. 5mM，温度26°C下培 养3h 6h。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术得到的多克隆抗体是用 ppGalNAc-T20的茎区一段蛋白作为抗原得到的；本专利技术制备的抗体不和与ppGalNAC-T20 具有最高同源性的ppGalNAc-TIO发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交 叉反应；本专利技术通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融 合表达，易于纯化；本专利技术克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点；本专利技术得到 的抗体不仅可以用于检测变性后的ppGalNAC-T20蛋白，还可以用于检测具有活性的天然 构象的ppGalNAc-T20蛋白。本专利技术中所涉及的菌株大肠杆菌DH5 a、大肠杆菌BL21 (DE3)已在《汪玲玲，杨辑， 黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48 (7) :963 969》文献中公开。本专利技术涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取 得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。附图说明图1为GST-short T20融合蛋白诱导表达电泳图；图2为GST-short T20融合蛋白纯化电泳图；图3为ppGalNAc_T20抗体纯化电泳图；图4为ppGalNAC-T20抗体与其它ppGalNAc-T的交叉特异性检测图；图5为检测ppGalNAc_T20抗体对不同浓度的GST-short T20蛋白的效价的 WesternBlotting 结果图；图6为检测ppGalNAc-T20抗体对在293T细胞中表达的不同浓度的 FLAG-ppGalNAc-T20 蛋白的效价的 Western Blotting 结果图；图7为用ppGalNAC-T20抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ２０抗原，其特征在于，该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。
【技术特征摘要】
一种ppGalNAc-T20抗原，其特征在于，该抗原为蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。2.一种编码权利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的核酸，其特征在于，该核酸的碱基 序列如SEQ ID NO 1所示。3.—种如权利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗体的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤步骤一，以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备 方法制备抗血清；步骤二，纯化抗血清，即得。4.一种如权利要求1所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗体的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤步骤一，克隆如SEQ ID NO 1所示的核酸片段；步骤二，利用步骤一所得核酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯 化，得蛋白质；步骤三，以步骤二所得蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化 抗血清，即得。5.根据权利要求4所述的ppGalNAC-T20抗原的多克隆抗体的制备方法，其特征是，步 骤一中，所述克隆，所用引物对具体为如SEQ ID NO 3所示的上游引物和SEQID NO 4所示 的下游引物。6.根据权利要求4所述的pp...
【专利技术属性】
技术研发人员：张延，彭灿，武功冬，邹霞，谢文娴，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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