本公开提供了一种修饰的蛋白质序列，即，重组地表达的聚糖结合蛋白质。所述聚糖结合蛋白质是齐整小核菌凝集素的变体，并且被修饰以包括诸如增强分子稳定性、减少N‑端甲硫氨酸杂质以及有助于蛋白质与其他生物和化学试剂的偶联的属性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及生物，尤其涉及一种用于癌症检测和疗法的重组聚糖结合蛋白质。本公开还涉及使用所述凝集素的疗法性组合物的表达、纯化和制备。
技术介绍
1、凝集素是一种发现且衍生自包括微生物、植物和动物的各种生物体的聚糖结合蛋白质。凝集素表现出高聚糖/碳水化合物特异性，并已知凭借其与特定单糖或低聚糖可逆结合的非催化结构域而使红细胞凝集。已知它们对细胞表面的碳水化合物部分具有结合特异性，而不会改变碳水化合物的性质。这个功能发现在通过生物标志物的检测、糖蛋白和糖脂的纯化的诊断或检测技术中以及细胞选择过程中有许多应用。
2、除了诊断学之外，研究凝集素以探索它们作为癌症疗法的有效性。近年来，随着癌症细胞表现出在其细胞表面上的碳水化合物结构的不同变化，许多凝集素已经被探索出它们选择性地与癌症抗原结合并发挥多种生理作用的能力，诸如细胞凋亡、细胞毒性、增殖/抗增殖活性、转移、抑制细胞黏附等。
3、虽然不同来源的凝集素表现出高的碳水化合物特异性，但它们的理化性质(诸如，分子尺寸和糖特异性)不同。少有植物凝集素(如槲寄生凝集素(mistletoe lectin，ml))是从白果槲寄生l(viscum album l.)的不同种获得的，在预防和治疗各种癌症中，它们作为有效的抗癌剂有着广泛的历史。在所有ml中，槲寄生凝集素-i(mistletoe lectin-i，ml-i)由于其细胞毒性和免疫调节功能而产生的抗增殖活性而受到高度研究。然而，使用植物来源的凝集素有其固有的缺点，诸如缺乏选择性、品质不一致且难以在工业规模上扩大生产。
4、美国专利号9500650公开了凝集素在通过凝集素-凝集素夹心法(lectin-lectinsandwich method)检测未分化糖链标志物中的有效性，从而能够确定存在或不存在分化细胞。所述专利中公开的凝集素包括利用重组dna技术衍生自齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)、灰盖鬼伞(coprinopsis cinerea)、双孢蘑菇(agaricus bisporus)、红绒盖牛肝菌(xerocomus chrysenteron)、橙黄网孢盘菌(aleuria aurantia)等的凝集素。所述专利没有公开凝集素的任何疗法能力。
5、发现肿瘤相关的碳水化合物结构、如汤姆森-弗里登瑞克(thomsenfriedenreich，tf)二糖(galβ1-3galnacα1-ser/thr)和n-乙酰氨基半乳糖(n-acetylgalactosamine，tn)单糖(galnac)在90％的癌变细胞上进行表达。齐整小核菌凝集素(sclerotium rolfsii lectin，srl)表现出对tf和tn抗原的特异性，并且是从植物病原真菌的硬化体(sclerotic body)纯化的。印度专利申请号1265/mum/2004公开了srl与一组人类细胞系的结合特异性代表用流式细胞仪分析研究的不同类型癌症。然而，来自天然来源的srl凝集素影响产量，存在纯化工艺的问题，从而使该工艺对于大规模生产所述凝集来说非常昂贵。另外，衍生自天然来源的凝集素存在溶解性和稳定性问题，进一步阻碍了所述凝集素在诊断和疗法中的可用性。
6、进一步地，蛋白质的合成是通过真核生物中的甲硫氨酸、或原核生物中的甲酰甲硫氨酸(n端甲硫氨酸)引发的。在重组蛋白质表达期间，n端甲硫氨酸被内源性甲硫氨酸胺基肽酶(methionine aminopeptidase，map)切割。所述切割过程并不有效，因为表达的重组蛋白质的量超过了有限数量map切割n端甲硫氨酸的能力，因此大量表达的蛋白质含有甲硫氨酸作为第一氨基酸，该甲硫氨酸不是成熟蛋白质的一部分。进一步地，具有n端甲硫氨酸的蛋白质在生产和储存期间容易氧化，且这种氧化必须仔细观察。当蛋白质中的甲硫氨酸残基被氧化时，可能会产生甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜，这可能进一步导致增加的免疫原性、无活性和聚集性；从而限制疗法性产品的临床有效性、稳定性和监管可接受性。
7、具有n端甲硫氨酸杂质的生物产品可能不具有与人体内的蛋白质的结构相同的结构；因此，当在人类受试者中施用时，可能导致来自受试者的意外免疫反应，从而导致无效的疗法功能。因此，在配制之前应将甲硫氨酸杂质从生物产品中去除或最少化是重要的。
8、印度授权专利号277986(申请号350/mum/2009)公开了一种衍生自天然齐整小核菌凝集素的、经修饰的重组表达的凝集素。所述专利还公开了一种用于制备在宿主细胞(诸如，大肠杆菌或酵母菌)中表达的重组凝集素的方法。进一步地，该方法包括基于衍生自土传真菌齐整小核菌凝集素的maldi ms/ms的氨基酸序列的凝集素基因的合成，以及其宿主细胞中的克隆。所述专利中提到的凝集素通常包括含有n端甲硫氨酸和不含有n端甲硫氨酸的凝集素的混合物，这可能会产生监管审批过程中的障碍。由于氨基酸序列中半胱氨酸残基的可用性，凝集素蛋白质也可能倾向于形成多聚体，特别是二聚体。
9、专利wo2020044296公开了表达蛋白质在宿主细胞中增加的溶解度可能改变或降低对该蛋白质对抗原结合特异性的亲和力。因此，重要的是，重组蛋白质必须在保持对特定抗原的结合亲和力的情况下表现出足够的稳定性以及显示出溶解性。
10、专利wo2020074977公开了一种用引发剂甲硫氨酸制备具有小于20％的重组凝集素的重组凝集素蛋白质的方法。所述专利利用上游和下游策略来降低具有n端甲硫氨酸变体/杂质的凝集素的表达。
11、另外，最近正在开发如靶向药物疗法的新型疗法概念，蛋白质药物偶联物(protein drug conjugates，pdc)，其中，抗体或蛋白质与具有细胞毒性活性的强效药物分子偶联，可选地通过化学接头。
12、理想的pdc对正常(健康)细胞中缺乏的抗原具有高度的特异性；将强效的细胞毒性剂(通常是具有高系统毒性的小分子药物)设计为在肿瘤细胞中内化后诱导靶细胞死亡；并且可选的化学接头是在循环中是稳定的但在靶细胞中释放细胞毒性剂。然而，化学接头的使用需要使用额外的化学过程和下游纯化。另外，大多数抗体都能与特定类型的癌细胞上特异表达的抗原结合。到目前为止，尚未报道在大多数癌细胞上表现出对通用抗原具有特异性的抗体。因此，在大多数癌细胞上表现出对通用抗原具有高度特异性的蛋白质正在进行科学研究。当这种蛋白质与强效药物分子偶联时，可能会为有效治疗多种癌症的普遍疗法铺平道路。
13、过去已经使用各种偶联化学法来制备蛋白质药物偶联物。少数已报道的偶联化学法包括赖氨酸偶联化学法、马来酰亚胺蛋白质偶联反应化学法等。对于抗体药物偶联物的制备，赖氨酸类偶联方法因其通用性和简单工艺要求、以及可以与多种细胞毒性剂(特别是在抗体上)反应而成为最优选的方法之一。但是，对于赖氨酸氨基酸残基存在于多个位置的蛋白质，所述方法可能导致产生异质性分子。并且异质性分子需要繁琐的纯化和表征过程，从而导致监管批准障碍。
14、需要一种稳定且易于溶解的蛋白质，该蛋白质能够容易地偶联以使具有改善的同质性的蛋白本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种重组聚糖结合蛋白质，所述重组聚糖结合蛋白质包括由SEQ ID NO:1所表示的齐整小核菌凝集素(SRL)的变体，其中，与野生型SRL相比，所述变体在羧基末端处包括额外的半胱氨酸；并且
2.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体的氨基酸序列与SEQ IDNO:1具有70％至99.99％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体在SEQ ID NO:1的第1个与第141个氨基酸位置之间缺少半胱氨酸(C)。
4.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置1处用丝氨酸(S)替换苏氨酸(T)。
5.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置76处用甘氨酸(G)替换半胱氨酸(C)。
6.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置142处添加半胱氨酸(C)。
7.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置142处和位置143处分别添加丝氨酸和半胱氨酸(C)。
8.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所表示。
9.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述蛋白质与试剂偶联。
10.根据权利要求9所述的蛋白质药物偶联物，其中，所述试剂选自包括以下的组：疗法剂、细胞毒性剂、放射剂、抗癌剂、诊断剂及它们的组合。
11.根据权利要求9所述的蛋白质药物偶联物，其中，所述蛋白质用于试剂的靶向递送。
12.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述蛋白质用于制备治疗癌症的药物。
13.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述蛋白质用于癌症的诊断或疗法性治疗。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包括：
15.一种编码根据权利要求1所述的蛋白质的重组多核苷酸。
16.一种用根据权利要求15所述的重组多核苷酸进行转染的细胞。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种重组聚糖结合蛋白质，所述重组聚糖结合蛋白质包括由seq id no:1所表示的齐整小核菌凝集素(srl)的变体，其中，与野生型srl相比，所述变体在羧基末端处包括额外的半胱氨酸；并且
2.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体的氨基酸序列与seq idno:1具有70％至99.99％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体在seq id no:1的第1个与第141个氨基酸位置之间缺少半胱氨酸(c)。
4.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置1处用丝氨酸(s)替换苏氨酸(t)。
5.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置76处用甘氨酸(g)替换半胱氨酸(c)。
6.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置142处添加半胱氨酸(c)。
7.根据权利要求1所述的重组聚糖结合蛋白质，其中，所述变体包括在位置...
【专利技术属性】
技术研发人员：达南杰·萨特，萨拉瓦纳库马尔·伊亚潘，高塔姆·巴克西，加内什·帕蒂尔，
申请(专利权)人：联合化学实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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