改进的重组凝集素蛋白制备方法技术

本发明专利技术为一种制备具有SEQ ID NO:l氨基酸序列的重组凝集素的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中以3:1到6:1的碳氮比的特定投料速率对克隆进行补料分批发酵。本发明专利技术还涉及具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的重组凝集素的纯化方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的重组凝集素蛋白制备方法该申请对于2018年9月7日提交的第201821008382号印度临时专利申请和于2019年1月14日提交的第201921001559号印度临时专利申请的权益进行了声明，其全部内容通过引用包含在本文中。
本专利技术是关于一种重组凝集素蛋白以及一种重组凝集素蛋白制备方法，特别是一种粗重组凝集素蛋白纯化方法。
技术介绍
凝集素属于碳水化合物结合蛋白，是对其他分子的糖基具有高度特异性的高分子。凝集素在细胞和分子水平上进行识别，并在涉及细胞、碳水化合物和蛋白质的生物识别现象中发挥许多不同的作用。凝集素为二价或多价碳水化合物结合蛋白，能够结合和沉淀糖蛋白并凝集红细胞。在动物体内发现的凝集素通常有助于细胞相互作用，而植物凝集素则能够抵御潜在捕食者或病原体。一些凝集素可以检测与肿瘤相关的聚糖，因此有可能作为恶性肿瘤的生物标志物，并可能有助于研究癌细胞系中糖基化基序的变化。纯化后的凝集素在临床环境中很重要，因为它们可用于血型鉴定。有些存在于人类红细胞上的糖脂和糖蛋白可采用凝集素进行识别。许多凝集素可用作指示恶性生长早期检测的生物标志物或用作自噬诱导剂，而其他凝集素还表现出通过细胞凋亡抑制癌细胞生长的能力。由于细胞增殖不受调节，有些碳水化合物部分在癌细胞上以抗原的形式表达。凝集素在癌症治疗中用作药物载体，因为它们能够与恶性肿瘤特异性结合。此外，由于凝集素还能够调节癌症相关通路，因此它们有可能用作癌症诊断和治疗药物。凝集素能够与多种抗原结合，抗原已在癌细胞表面进行表征；大多数抗原都是针对特定类型的癌症，凝集素与这些抗原的结合可以通过诱导癌细胞凋亡而抑制癌细胞生长。目前，大多数市场上可买到的凝集素来自植物和其他真核生物。齐整小核菌凝集素(SRL)是从土生植物病原真菌齐整小核菌的菌核体中分离出来的凝集素。SRL对Thomsen-Friedenreich(TF)抗原和Tn抗原具有特异性。TF抗原是一种二糖(Galβ1→3GalNAc-α-Ser/Thr)，在各种不同人类癌细胞的细胞表面上过表达。Tn抗原是一种单糖(GalNAc-α-)。由于对TF和Tn抗原的特异性，SRL已经证明能够与人类结肠癌、卵巢癌和白血病细胞结合。SRL的晶体结构已经确定(Leonidas等人，《分子生物学杂志》，2007年5月11日；368(4)：1145-61)。虽然凝集素作为抗癌工具有许多优势，但它们仍然有许多局限性，如缺乏选择性、质量和性能不一致以及不易规模化生产。此外，经常报道植物凝集素可与一系列不同的聚糖结构结合，因此缺乏许多应用所需的选择性。而且，在使用植物凝集素时，逐批质量差异也很常见。产品的质量取决于植物材料的分离方法，以及起始植物材料本身的质量。从天然来源中分离凝集素是不可靠的，因为这样获得的凝集素与期望的性质不一致。进一步从天然来源中分离蛋白质的过程费用高且难度大。分离自然产生的凝集素所用的技术产量一般非常低，特别是在蛋白质浓度低时。这些技术有时还不能区分同一种凝集素的异构体。因此，所得的产物为混合物，有很大的不确定性。从这个意义上来说，通过重组DNA技术生产重组凝集素的优点是可提供单纯蛋白质，在极短的时间内具有更高且一致的产量，表征准确，同时易于规模化生产。利用rDNA技术，可以将产生相关蛋白质的基因转移到合适的宿主体内。这样，与传统方法相比，蛋白质的生产和分离需要的时间和精力更少。WO2010/095143公开了重组凝集素变体Rec-2和Rec-3，其分别通过替换3个或5个氨基酸而从天然SRL序列中获得。这些变体的晶体结构均有报道(Peppa等人，《分子杂志》，2015年6月12日；20(6)：10848-65)。WO2014/203261公开了通过替换12个氨基酸而从天然SRL序列中获得的重组凝集素变体。印度专利申请350/MUM/2009(PCT申请WO2010/095143)首次公开了从来源于齐整小核菌的SEQIDNO.2(在350/MUM/2009中被命名为SEQID1)天然氨基酸序列中获得的SEQIDNO.1氨基酸序列(在350/MUM/2009中被命名为SEQID2)。WO2010/095143描述了重组凝集素在大肠杆菌细胞中的实验室规模生产，其中重组凝集素的基因编码被克隆到表达载体中。然而，所述方法存在某些缺点，包括难以控制溶解氧量和pH等培养参数以及缺乏对蛋白质表达的控制。此外，培养物产生的细胞数量少，因此导致纯化后的蛋白的总产量低。此外，所述方法无法实现工业上的规模化生产。具有SEQIDNO.1氨基酸序列的凝集素与来源于齐整小核菌的天然凝集素相比具有高稳定性和高溶解性，并表现出了癌细胞结合特性。凝集素在研究、医学和生化技术中有多种用途。例如，具有SEQIDNO.1氨基酸序列的凝集素拥有很高的药用潜力。因此，需要设计出一种产量更高、成本效益更高、更易于规模化和/或效率更高的重组凝集素生产方法。本专利技术已在其设计时考虑到了这些问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是克服现有技术参考文献的缺点，并设计出一种高效制备SEQIDNO.1氨基酸序列的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种产量高、成本效益高且可使用容易获得的原料进行生产的方法。本专利技术还有一个目的是提供一种易于规模化制备SEQIDNO.1氨基酸序列的方法。本专利技术还有一个目的是提供一种生产高纯度SEQIDNO.1氨基酸序列的方法。本专利技术的一个方面提供了一种制备重组凝集素蛋白的方法，所述方法包括在培养的宿主细胞中表达由重组凝集素基因编码的重组凝集素蛋白，其中表达在使细胞倍增时间不超过160分钟的条件下进行。在一些实施例中，表达在使细胞倍增时间至少为100分钟的条件下进行。在一个实施例中，所述方法包括在不超过22℃的温度下，在培养的宿主细胞中表达由重组凝集素基因编码的重组凝集素蛋白。在另一个实施例中，表达在至少15℃且不超过22℃的温度下进行。在一些实施例中，用于表达重组凝集素的宿主细胞为大肠杆菌。在一些实施例中，重组凝集素蛋白选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或与其中任何一种序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，宿主细胞培养物的体积至少为10L。在一些实施例中，所述方法包括培养宿主细胞，其中所述培养包括：在蛋白表达之前使宿主细胞生长的生长期，以及进行蛋白表达的表达期。在另一些实施例中，生长期的温度高于表达期的温度。在另一些实施例中，从生长期到表达期所经历的温度下降时间至少为4小时且不超过7小时。在一些实施例中，表达期通过添加浓度至少为0.1mM且不超过0.7mM的诱导剂进行诱导。在其他实施例中，所述诱导剂以不超过0.5mM的浓度添加到培养物中。在其他一些实施例中，表达期在培养物光密度至少为25且不超过40的情况下通过添加诱导剂进行诱导。在一些实施例中，所述方法包括在培养物光密度至少为25且不超过40时通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，所述制备重组凝集素蛋白的方法包括：在培养物的宿主细胞中表达由重组凝集素基因编码的重组凝集素蛋白，其中表达是在细胞具有不超过160分钟倍增时间的条件下进行。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180907 IN 201821008382;20190114 IN 2019210015591.一种制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，所述制备重组凝集素蛋白的方法包括：在培养物的宿主细胞中表达由重组凝集素基因编码的重组凝集素蛋白，其中表达是在细胞具有不超过160分钟倍增时间的条件下进行。


2.根据权利要求1所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中在细胞具有至少100分钟倍增时间的条件下进行表达。


3.根据权利要求1所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中在温度至少15℃且不超过22℃的温度下进行表达。


4.根据权利要求1所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述宿主细胞培养物的体积至少为10升。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中还包括培养宿主细胞，所述培养宿主细胞还包括：在蛋白表达之前使宿主细胞生长的生长期，以及进行蛋白表达的表达期。


6.根据权利要求5所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述生长期在高于进行表达期的温度下进行。


7.根据权利要求5或6所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中在至少4小时且不超过7小时的时间内将温度从生长期降至表达期。


8.根据权利要求5至7中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中通过加入浓度至少为0.1mM且不超过0.7mM的诱导剂来诱导表达期。


9.根据权利要求5至8中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中当培养物的光密度至少为25且不超过40时，通过添加诱导剂来诱导表达期。


10.根据权利要求9所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中光密度是培养物中宿主细胞群体的量度在600纳米处测量。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中用于表达重组凝集素蛋白的宿主细胞是大肠杆菌。


12.根据权利要求8至11中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述诱导剂为IPTG。


13.根据权利要求8至12中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述诱导剂以不超过0.5mM的浓度添加到所述培养物中。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述重组凝集素蛋白选自以下：
a.SEQIDNO.1；
b.SEQIDNO.3；
c.SEQIDNO.4；或
d.与a、b或c具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中进一步包括：
a)可选的，将重组凝集素基因克隆到表达载体中并将所述表达载体插入宿主细胞中；
b)在合适的培养基中培养所述宿主细胞，其中所述培养包括在25℃到40℃的温度下进行的生长期和表达由重组凝集素基因编码的重组凝集素蛋白的表达期，其中所述生长期的温度为15℃到30℃并且所述表达期内维持的碳氮比为3∶1到6∶1；
c)可选的，分离(b)中表达的所述重组凝集素蛋白以获得粗重组凝集素蛋白；以及
d)可选的，纯化所述粗重组凝集素蛋白以获得重组凝集素蛋白分离物。


16.根据权利要求1所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中所述步骤(a)中的表达载体如图1所示。


17.根据权利要求15所述的制备重组凝集素蛋白的方法，其特征在于，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：达南杰·萨特，苏迪普·库马尔，马马塔·卡特代尔，
申请(专利权)人：联合化学实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN