一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了医药技术领域，涉及一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，包括刀豆蛋白A、药物溶液。刀豆蛋白A，是以刀豆种子为原料，溶解于甲酸溶液中进行提取，再用硫酸铵分级沉淀，透析，经HPLC分析得到刀豆蛋白A将得到的刀豆蛋白A溶解于pH7.3‑7.4药物溶液中，刀豆蛋白A的溶解浓度为1‑10mg/ml，得到药物制剂。本发明专利技术方法简单稳定，可有效促进血管新生，为修复缺血肢体和心肌带来机遇。局部注射使用，可用于治疗肢体缺血以及心梗引起的心力衰竭、缺血性心肌病、心肌瘤等，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。

【技术实现步骤摘要】
一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用
本专利技术涉及医药
，具体是一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用。
技术介绍
本专利技术使用的药物：刀豆蛋白A（ConcanavalinA，缩写ConA）是一种糖类结合蛋白质，又叫刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀豆素、刀豆凝集素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应的作用，其促淋巴细胞转化最适浓度为40-100μg/ml，能沉淀肝糖原，凝集羊、马、狗、兔、猪、大鼠、小鼠、豚鼠等动物及人红细胞。还能选择性激活抑制性T细胞（Ts）细胞，对调节机体免疫反应具有重要作用。心脏是在人体内最缺乏再生能力的器官，心脏缺血后组织的修复更是困难，心肌的新陈代谢非常活跃，一旦心梗，心肌在供血中断后的几小时内会很快死亡。而且心脏自身无法长出新的心肌，只能通过形成疤痕而愈合。目前还没有治疗方法可以修复心肌组织的损伤，即便心梗患者抢救成功，由此导致的心肌功能减弱也会引起心力衰竭等并发症。其中，心梗组织中的血管新生是治疗和修复受损心肌的关键。目前，国内外尚没有关于刀豆蛋白A局部使用促进血管新生的有效方案和药物，本专利技术提供一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，方法简单稳定，可有效促进血管新生，为修复缺血肢体和心肌带来机遇。局部注射使用，可用于治疗肢体缺血以及心梗引起的心力衰竭、缺血性心肌病、心肌瘤等，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，局部注射给药以达到局部血管再生目的，本专利技术提供如下技术方案：优选地，一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，包括刀豆蛋白A、药物溶液，制备方法为：刀豆蛋白A，是以刀豆种子为原料，溶解于提取溶剂中，所述提取溶剂中氯化钠浓度为0.1-0.3mol/L、甲酸浓度为0.6-0.8mol/L、料液比为1:50-100(质量/体积)，提取温度在20-24℃、提取时间为2-5小时得到提取溶液；再取提取溶液20000g离心30分钟，去掉沉淀，测量体积，边搅拌边慢慢加入饱和硫酸铵（CAS：7783-20-2）溶液（将767g硫酸铵溶于1升蒸馏水中，调pH到7.0）到入提取溶液中，最终浓度为1:1，溶液放在磁力搅拌器搅拌6小时，使蛋白质沉淀，得到沉淀物；取沉淀物溶解于15毫升PBS-0.2/L叠氮钠（CAS：26628-22-8）中，放入透析袋（上海胜创生物科技有限公司），透析48小时，每隔6小时换透析液一次，最终得到上清液，即为刀豆蛋白A溶液；去刀豆蛋白A溶液经HPLC分析得到纯净的刀豆蛋白A，将得到的刀豆蛋白A溶解于pH7.3-7.4药物溶液中，刀豆蛋白A的溶解浓度为1-10mg/ml，得到混合溶剂，药物溶液是磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、牛血清白蛋白与水的混合物，浓度分别为，1.8mmol/L、10mmol/L、137mmol/L、2.7mmol/L、1mmol/L，pH值在7.3-7.4之间。优选地，所述的提取溶剂中氯化钠CAS号为7647-14-5甲酸CAS号为64-18-6。优选地，所述药物溶液是中磷酸二氢钾（7778-77-0）、磷酸氢二钠（7558-80-7）氯化钠（7647-14-5）、氯化钾（7447-40-7）、牛血清白蛋白与水的混合物，浓度分别为，1.8mmol/L、10mmol/L、137mmol/L、2.7mmol/L、1mmol/L，pH值在7.3-7.4之间，其中牛血清白蛋白是为了保护刀豆蛋白A稳定性的蛋白，混合后得到药物制剂。优选地，所述溶剂混合，涡旋振荡仪（ThermoScientific涡旋振荡器）振荡，使其充分溶解，振荡时间为5小时，振荡速率为2500rpm，提取效率最高。下面结合具体实施例进一步阐明本专利技术的作用，应理解，这些实施案例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。有益效果与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：目前，国内外尚没有关于刀豆蛋白A局部使用促进血管新生的报道，本专利技术制备方法简单稳定，可有效促进人脐静脉内皮细胞的血管新生作用，促进细胞增殖，局部使用，对缺血引起的肢体疾病和心梗后的心功能修复有明显作用，也可用于心梗引起的缺血性心肌病、心衰以及心肌瘤的心肌和血管修复，药理作用明确，用量很小，无毒副作用。附图说明图1为本专利技术对人脐静脉内皮细胞血管新生作用对照图。图2为本专利技术对人脐静脉内皮细胞血管新生相关蛋白分泌的作用对照图。图3为本专利技术对人脐静脉内皮细胞活性的作用对照图。图4为本专利技术对人脐静脉内皮细胞增殖的作用对照图。图5为本专利技术对人脐静脉内皮细胞细胞周期的作用对照图。图6为本专利技术对人脐静脉内皮细胞增殖和血管新生的信号通路蛋白的作用对照图。图7为本专利技术对后肢缺血小鼠后肢修复效果对照图。图8为本专利技术对心肌梗死小鼠心功能改善对照图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术，应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围；在本专利技术说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。实施例1如图1：应用matrigel基质胶方法检测，相对于溶剂对照组，刀豆蛋白A对人脐静脉内皮细胞的血管新生有明确促进作用（见图1A），应用ImageJ软件进行血管生成分析，刀豆蛋白A3ug/ml和10ug/ml对主段总长度相对阴性对照组分别升高到2.65和3.345倍（见图1B），刀豆蛋白A3ug/ml和10ug/ml对成管总长度相对阴性对照组分别升高到1.43和1.49倍（见图1C），刀豆蛋白A3ug/ml和10ug/ml对总节点长度相对阴性对照组分别升高到2.65和3.32倍（见图1D），提示刀豆蛋白A10ug/ml促进血管内皮细胞的血管新生作用最佳。实施例2本专利技术对人脐静脉内皮细胞血管新生相关蛋白分泌的作用。...

【技术保护点】
1.一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，包括刀豆蛋白A、药物溶液，其特征在于：所述刀豆蛋白A，是以刀豆种子为原料，溶解于提取溶剂中进行提取得到提取溶液，再用硫酸铵分级沉淀得到沉淀物，透析得到刀豆蛋白A溶液，经HPLC 分析得到刀豆蛋白A，将得到的刀豆蛋白A溶解于pH7.3-7.4药物溶液中，刀豆蛋白A的溶解浓度为1-10mg/ml，得到药物制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，包括刀豆蛋白A、药物溶液，其特征在于：所述刀豆蛋白A，是以刀豆种子为原料，溶解于提取溶剂中进行提取得到提取溶液，再用硫酸铵分级沉淀得到沉淀物，透析得到刀豆蛋白A溶液，经HPLC分析得到刀豆蛋白A，将得到的刀豆蛋白A溶解于pH7.3-7.4药物溶液中，刀豆蛋白A的溶解浓度为1-10mg/ml，得到药物制剂。


2.根据权利要求1所述的一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，其特征在于：所述提取溶剂中氯化钠浓度为0.1-0.3mol/L、甲酸浓度为0.6-0.8mol/L、料液比为1:50-100(质量/体积)，在涡旋振荡条件下提取，提取温度在20-24℃、提取时间为2-5小时得到提取溶液。


3.根据权利要求1所述的一种促进局部血管新生的蛋白的制备及应用，其特征在于：所述硫酸铵分级沉淀，取提取溶液20000g离心30分钟，去掉沉淀，测量体积，边搅拌边慢慢加入饱和硫酸铵（CAS：7783-20-2）溶液（将767g硫酸铵溶于1升蒸馏水中，调pH到7.0），最终浓度为1:1，溶液放在磁力搅拌器搅拌6小时，使蛋白质沉淀，得到沉淀物。


4.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，王焱，李荆州，
申请(专利权)人：李刚，
类型：发明
国别省市：新疆;65