一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制伪狂犬病毒侵染的BanLec重组蛋白，通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。以IPEC‑J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性。通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬病毒的抑制率可达99.10％，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种BanLec重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus,PRV)是疱疹病毒科的一种双链DNA囊膜病毒，能感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物，引发以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的伪狂犬病。PRV具有典型的疱疹病毒粒子结构，直径一般200nm左右，在电子显微镜下观察呈圆形或者椭圆形。成熟的病毒粒子由外到内主要包括囊膜、蛋白质皮层、核衣壳和双链线状基因组DNA，其中囊膜含有11个功能多样的糖蛋白包括gB、gC、gD等。猪是PRV的自然宿主和贮存宿主，受PRV感染后，成年猪出现呼吸道症状并可建立终身性潜伏感染，仔猪出现脑脊髓炎，病死率可达100％，怀孕母猪流产、死胎。2011年PRV强变异毒株在我国出现，不仅给生猪养殖行业造成巨大经济损失，还出现多起感染人的病例，PRV已成为公共卫生和健康养殖领域共同面临的一个重要威胁，抗PRV蛋白抑制剂的开发对于PRV的有效防控具有重要意义。香蕉凝集素(BanLec)，是一种从成熟的香蕉果实里分离出来的二聚体的蛋白，分子量约30kDa。它采用的是β-三棱镜(β-prism)折叠模式，包含三个希腊钥匙转角基序，希腊钥匙基序1和2都含有一个可以结合高甘露糖的GXXXD基序。BanLec被报道能够结合在某些富含甘露糖的病毒上(比如HIV、HCV、Influenzavirus)从而阻断病毒侵染细胞的进程。但目前尚未报道它是否抑制伪狂犬病毒的侵染和增殖。然而，BanLec同时也具有分裂素的活性，能够激活细胞的增殖，从而产生一定的副作用。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，能够抑制伪狂犬病毒感染，但去除了刺激细胞增殖的副作用。本专利技术提出一种BanLec重组蛋白，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端添了亮氨酸和谷氨酸。在本专利技术的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白的C末端还添加了蛋白标签。在本专利技术的一些优选实施方式中，所述蛋白标签为HIS6标签。在本专利技术的一些实施方式中，所述BanLec重组蛋白具有：(I)：如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列：MNGAIKVGAWGGNGGSAFDMGPAYRIISVKIFSGDVVDGVDVTFTYYGKTETRHYGGSGGTPHEIVLQEGEYLVGMAGEVANYTGAVVLGKLGFSTNKKAYGPFGNTGGTPFSLPIAAGKISGFFGRGGKFLDAIGVYLEPLEHHHHHH；(II)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；(III)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；(IV)：与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)序列至少有80％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。本专利技术还提出一种核酸分子，所述核酸分子编码上述氨基酸。本专利技术还提出一种表达载体，所述表达载体包含上述核酸分子。本专利技术还提出一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。本专利技术还提出一种菌株，所述菌株包含上述表达载体。本专利技术还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备抑制疱疹病毒感染药物中的应用。本专利技术还提出上述BanLec重组蛋白或核酸分子或表达载体或宿主细胞或菌株在制备治疗伪狂犬病毒药物中的应用。本专利技术还提出一种药物，所述药物含有上述BanLec重组蛋白。在本专利技术的一些实施方式中，所述药物还包含药学可接受的载体和/或辅料。在本专利技术的一些实施方式中，所述药物的形式为注射剂、胶囊或贴剂。在本专利技术的一些实施方式中，所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。在本专利技术的一些实施方式中，所述药物为疫苗。本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一种重组BanLec重组蛋白，该蛋白保留了抗病毒的活性，但去除了刺激细胞增殖的副作用，并在C端带有组氨酸标签，为该蛋白的检测和纯化提供了便利条件。通过体外原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的BanLec重组蛋白。本专利技术还以IPEC-J2为细胞模型，检测了该重组蛋白对伪狂犬病毒感染细胞是否有抑制活性，通过CPE观测和病毒滴度测定发现该蛋白可以抑制伪狂犬病毒感染引起的细胞病变和死亡，并能显著抑制病毒侵染宿主细胞，蛋白用量在100μg/mL的条件下，对伪狂犬病毒的抑制率可达99.10％，所述蛋白可用于阻断伪狂犬病毒对宿主细胞的侵染，可明显缓解伪狂犬病毒感染引发的细胞病变，可能通过结合伪狂犬病毒gH等蛋白表面的甘露糖分子来阻断病毒感染细胞，该重组蛋白在伪狂犬病毒防治生物制剂中有潜在的应用前景，并可拓展至抑制疱疹病毒对细胞的侵染。附图说明图1为本专利技术实施例1中的BanLecH84T表达分析。图2为本专利技术实施例1中的BanLecH84T亲和层析纯化结果图。图3为本专利技术实施例2中的BanLecH84T和PRV处理对细胞的影响。图4为BanLecH84T抑制伪狂犬病毒的复制；其中A图为BanLecH84T对PRV的滴度检测，B图为BanLecH84T对PRV的抑制率。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。实施例11.重组质粒BanLecH84T-pET24b的构建及转化通过酶切位点NdeI和XhoI将BanLecH84T编码区连入含C端HIS标签的载体pET24b获得重组表达质粒。将1μl重组质粒BanLecH84T-pET24b加到装有100μlRosettaBluepLysSE.colicells感受态的1.5mlEP管中，冰浴30min，42℃90s，再次放置在冰上3min，向管中加入0.5ml2YT液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。取出EP管，2500rpm离心5min，去除上清，轻轻吹打悬菌。将取上述菌液涂布于含卡那霉素的筛选平板上,然后正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。2.BanLecH84T蛋白的表达设置不同诱导条件对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BanLec重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种BanLec重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括BanLec蛋白的氨基酸序列，并且包括在第84位氨基酸处的突变，第84位氨基酸由组氨酸突变为苏氨酸。


2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述BanLec重组蛋白的C末端添了亮氨酸、谷氨酸。


3.根据权利要求1或2任一项所述的BanLec重组蛋白，其特征在于，所述BanLec重组蛋白具有：
(I)：如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(II)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(III)：如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；
(IV)：与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)序列至少有80％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓爱，梁卫星，魏文康，李玉谷，曹婉怡，俞婷，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：广东;44