【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质表达领域。更具体而言，它涉及用于增加重组多肽和蛋白质表达的构建体和方法。
技术介绍
1、自20世纪20年代胰岛素疗法问世以来，肽治疗剂在医疗实践中发挥了重要作用。目前，市场上获批的肽类药物已超过60种，并且预计这一数字还将大幅增长。
2、具有商业价值的蛋白质和肽类可以通过合成方式生成或者从天然来源中分离出来。然而，这些方法往往价格昂贵、耗时，并且其特征是生产能力有限。产生蛋白质和肽的优选方法是通过重组构建的生物体的发酵，这些生物体经过工程化改造以过表达感兴趣的蛋白质或肽。
3、然而，为了使肽的重组表达成为一种符合成本效益的产生手段，还需要克服许多障碍。这些障碍通常与重组蛋白的低表达水平或细胞内包含的蛋白水解酶对所表达多肽的破坏有关。
4、通过重组方式产生短肽是具有挑战性的，因为它们在细胞环境中容易被宿主细胞蛋白酶降解。因此，所分离出的产物可能是具有不同氨基酸链长度的所需多肽种类的异质性混合物。
5、另外，可能很难进行纯化，导致产量很低，具体取决于感兴趣蛋白质或肽的性质。为了克服上述难题，通过与大的融合标签进行融合来表达小肽。此外，当前的方法使用大的融合标签来表达融合蛋白，这降低了感兴趣的肽的潜在产量。在感兴趣的蛋白质或肽尺寸较小的情况下，这会出现问题。
6、在这种情况下，使用小尺寸融合标签以最大限度地提高感兴趣肽的产量是有利的。但在通常情况下，小标签很少能像大标签那样有效。
7、这些问题在过去已经通过产生含有与载剂多肽融合的所需多肽的融合
8、美国专利号7572884公开了一种用于在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中制备重组利拉肽(lira-peptide)，即利拉鲁肽(liraglutide)前体的方法。
9、美国专利号7662913公开了基于胱抑素(cystatin)的肽标签的使用，其用于产生不溶性融合肽。
10、美国专利号8796431公开了使用酮类固醇异构酶(ksi)作为包涵体伴侣来有效产生肽类包括glp1的方法和过程。
11、wo 2003/100021 a1公开了用于增加异源肽/蛋白质产生的表达盒，其包含与异源蛋白质可操作地连接的启动子、翻译起始序列、包涵体融合伴侣和可切割接头。
12、wo 2017/021819 a1公开了一种通过在原核细胞中以泛素融合构建体的形式表达编码所需蛋白质或肽的合成寡核苷酸来制备肽或蛋白质或者其衍生物的工艺。
13、in 201741024763 a公开了一种通过在酵母细胞中表达编码利拉肽的合成寡核苷酸来制备利拉鲁肽的工艺，该合成寡核苷酸与信号肽的寡核苷酸序列可操作地连接。
14、yang liu等人,(biotechnol lett 36,1675–1680(2014))解释了一种使用23kda的谷胱甘肽s-转移酶(gst)融合标签在大肠杆菌中表达和纯化功能性glp-1肽的策略，其中在融合连接处具有肠激酶切割位点。
15、zhao等人,(microb cell fact 15,136(2016))研究了在大肠杆菌中可切割的自聚集标签的重组表达以及内含肽介导的对中型至大型肽类包括glp1的切割。
16、zhao等人,(microb cell fact 18,91(2019))研究了使用自组装双亲性肽(sap)作为表达标签来提高重组酶的生产。
17、ki等人,(appl microbiol biotechnol.2020年3月；104(6):2411-2425)提供了增加异源蛋白在大肠杆菌中表达的融合标签的详细综述。
18、胰高血糖素样肽-1(glp-1)是一种31个氨基酸长的肽类激素，来源于对胰高血糖素原肽的组织特异性翻译后加工。它由肠道内分泌l细胞和脑干中孤束核内的某些神经元在摄食时产生和分泌。利拉鲁肽是人肠促胰岛素(代谢激素)即胰高血糖素样肽-1(glp-1)的一种衍生物，用作长效胰高血糖素样肽-1受体激动剂，与刺激胰岛素分泌的内源性代谢激素glp-1结合相同的受体。因此，需要新的表达策略来提高重组蛋白在宿主中的表达。本专利技术的专利技术人在努力将重组治疗性肽的表达提高数倍的过程中，已经提出了允许高产率产生重组蛋白的表达构建体。
19、本专利技术的目的
20、本专利技术的主要目的是提供一种用于以高产率产生感兴趣蛋白质的表达盒。
21、本专利技术的另一个目的是提供一种增加感兴趣蛋白质表达的方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供了用于生物活性肽例如利拉肽的增加的表达和高效的产生的表达构建体、载体和重组宿主细胞。
2、在一个实施方案中，本专利技术提供了一种用于表达感兴趣蛋白质的表达盒，其包含：
3、a)编码包含氨基酸序列seq id no:1的t7前导多肽的多核苷酸；
4、b)编码表达标签多肽的多核苷酸，该表达标签多肽包含选自包含seq id no:2-10的组的氨基酸序列；
5、c)编码可切割肽接头的多核苷酸；以及
6、d)编码感兴趣蛋白质的多核苷酸，其中所述表达盒的所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
7、在特定的实施方案中，本专利技术提供了一种融合多肽，其包括与感兴趣蛋白质的氨基末端融合以获得融合多肽的以下项：
8、a)包含氨基酸序列seq id no:1的t7前导多肽；
9、b)表达标签多肽，其具有选自包含seq id no:2-10的组的氨基酸序列；以及
10、c)可切割肽接头。
11、本专利技术提供了一种用于表达利拉肽的表达盒，其包括：
12、a)编码包含氨基酸序列seq id no:1的t7前导多肽的多核苷酸；
13、b)编码表达标签多肽的多核苷酸，该表达标签多肽包含选自包含seq id no:2-10的组的氨基酸序列；
14、c)编码可切割接头的多核苷酸；以及
15、d)编码利拉肽的多核苷酸，该利拉肽包含如seq id no:12中所示的氨基酸序列或其功能性变体，
16、其中所述表达盒的所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
17、在一个实施方案中，专利技术提供了一种融合多肽，其包括：
18、a)包含氨基酸序列seq id no:1的t7前导多肽；
19、b)表达标签多肽，其具有选自包含seq id no:2-10的组的氨基酸序列；以及
20、c)可切割接头肽；
21、上述项与包含氨基酸序列seq id no:12或其功能性变体的利拉肽的氨基末端融合以获得融合多肽。
22、在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于表达感兴趣蛋白质的表达盒，其中所述表达盒包含：
2.权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒进一步包含编码多组氨酸标签的多核苷酸。
3.权利要求1所述的表达盒，其中所述可切割接头包含具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的经修饰的TEV蛋白酶切割位点。
4.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质包含少于100个氨基酸的治疗性肽。
5.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质选自包含利拉肽、特立帕肽、艾塞那肽、利司那肽、替度鲁肽和司美格鲁肽的组。
6.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质是利拉肽。
7.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质的表达水平增加了至少85％。
8.一种用于表达利拉肽的表达盒，其中所述表达盒包含：
9.权利要求8所述的表达盒，其中所述可切割接头包含具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的经修饰的TEV蛋白酶切割位点。
10.权利要求1-8中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:36-
11.一种用于表达感兴趣蛋白质的表达载体，其中所述表达载体包含至少一个拷贝的来自权利要求1-10中任一项的表达盒。
12.权利要求1所述的表达盒或权利要求11所述的表达载体，用于表达感兴趣蛋白质。
13.一种用于提高感兴趣蛋白质的产生的宿主细胞，其包含表达载体，其中所述表达载体包含来自权利要求1-10的任何一种表达盒。
14.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自包含大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的组。
15.权利要求14所述的宿主细胞，其中大肠杆菌菌株选自包含BL21(DE3)、BL21 Al、HMS174(DE3)、DH5ct、W31 10、B834、origami、Rosetta、NovaBlue(DE3)、Lemo21(DE3)、T7、ER2566和C43(DE3)的组。
16.一种融合多肽，其包含与感兴趣蛋白质的氨基末端融合以获得所述融合多肽的以下项：
17.权利要求16所述的融合多肽，其中所述融合多肽进一步包括多组氨酸标签。
18.权利要求16所述的融合多肽，其中所述可切割接头包含具有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的经修饰的TEV蛋白酶切割位点。
19.权利要求16所述的融合多肽，其中所述感兴趣蛋白质包含长度小于100个氨基酸的治疗性肽。
20.权利要求16所述的融合多肽，其中所述感兴趣蛋白质选自包含利拉肽、特立帕肽、艾塞那肽、利司那肽、替度鲁肽和司美格鲁肽的组。
21.权利要求16所述的融合多肽，其中所述感兴趣蛋白质是SEQ ID NO:12的氨基酸序列中所示的利拉肽或其功能等同物。
22.权利要求16所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:14-22中所示的氨基酸序列。
23.一种产生感兴趣蛋白质的方法，其中所述方法包括以下步骤：
24.权利要求23所述的方法，其中所述感兴趣蛋白质选自包含利拉肽、特立帕肽、艾塞那肽、利司那肽、替度鲁肽和司美格鲁肽的组。
25.权利要求23所述的方法，其中所述感兴趣蛋白质是SEQ ID NO:12的氨基酸序列中所示的利拉肽或其功能等同物。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于表达感兴趣蛋白质的表达盒，其中所述表达盒包含：
2.权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒进一步包含编码多组氨酸标签的多核苷酸。
3.权利要求1所述的表达盒，其中所述可切割接头包含具有seq id no:11中所示的氨基酸序列的经修饰的tev蛋白酶切割位点。
4.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质包含少于100个氨基酸的治疗性肽。
5.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质选自包含利拉肽、特立帕肽、艾塞那肽、利司那肽、替度鲁肽和司美格鲁肽的组。
6.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质是利拉肽。
7.权利要求1所述的表达盒，其中所述感兴趣蛋白质的表达水平增加了至少85％。
8.一种用于表达利拉肽的表达盒，其中所述表达盒包含：
9.权利要求8所述的表达盒，其中所述可切割接头包含具有seq id no:11中所示的氨基酸序列的经修饰的tev蛋白酶切割位点。
10.权利要求1-8中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒包含seq id no:36-44中所示的多核苷酸序列。
11.一种用于表达感兴趣蛋白质的表达载体，其中所述表达载体包含至少一个拷贝的来自权利要求1-10中任一项的表达盒。
12.权利要求1所述的表达盒或权利要求11所述的表达载体，用于表达感兴趣蛋白质。
13.一种用于提高感兴趣蛋白质的产生的宿主细胞，其包含表达载体，其中所述表达载体包含来自权利要求1-10的任何一种表达盒。
14.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自包含大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·R·雷嘉蒂，R·V·马图尔，N·D·曼特纳，M·达特拉，
申请(专利权)人：生物学E有限公司，
类型：发明
国别省市：
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