【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及慢病毒包装系统。
技术介绍
1、慢病毒属于逆转录病毒科慢病毒亚科。与其他的逆转录病毒载体不同，慢病毒载体可以介导目的基因整合至非分裂细胞，例如干细胞、淋巴细胞、树突状细胞和神经细胞。除了用于体外细胞基因转导，慢病毒也可用于体内基因转导、基因治疗。慢病毒的亲本病毒包括人灵长类慢病毒(hiv)、非人灵长类和非灵长类慢病毒如猴免疫缺陷病毒(siv)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒(eiav)、山羊关节炎/脑炎病毒(caev)和牛jembrana病毒等。
2、常用的慢病毒载体来自于改造的人类免疫缺陷病毒(hiv-1)。hiv-1的基因组由两条相同的正股rna链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。病毒基因组全长约9200bp，含有gag、pol、env 3个结构基因以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu 6个调节基因。在病毒基因组的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列，称为长末端重复序列(long terminalrepeat,ltr)，含有启动子、rna反转录为dna后整合入宿主细胞dna的酶切识别序列。gag基因编码p55的蛋白前体，经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7)、内膜蛋白(p17)和衣壳蛋白(p24)。pol基因编码病毒复制所需的酶类，主要有3种，逆转录酶、蛋白酶和整合酶。env编码gp120和gp41两种包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性。调节基因与野生型hiv-1病毒的生活周期以及毒力密切相关。成熟的hiv-1病毒直径100-120nm、呈2
3、人工改造hiv-1时，将携带转基因的包装、整合元件和编码的gag、pol、env基因分布于不同质粒，用于包装、制备慢病毒。载体系统包括3质粒、4质粒包装系统，分别包括携带目的基因的穿梭质粒、携带病毒结构成分和/或rev基因的包装质粒，以及编码包膜蛋白的质粒。质粒系统去除了hiv-1的毒力相关调节基因，瞬时转染工程细胞，包装为无复制能力，仅具备一次感染能力、能够整合入宿主细胞基因组的非复制型病毒。人工改造的慢病毒系统，没有使用野生型病毒的包膜env基因，而是使用vsv-g基因，vsv-g膜蛋白使慢病毒感染宿主的范围不再仅限于cd4+(env的结合受体)细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞。
4、对于人工改造的慢病毒系统，生产制造和临床应用时主要考虑：(1)可能因质粒间重组，或和细胞内源性病毒重组，产生具有复制能力的慢病毒；(2)病毒基因组插入至宿主细胞基因组活性基因内部或邻近位点，可能引起肿瘤起始或促进肿瘤发生。
5、近年来，利用慢病毒载体介导基因进入免疫细胞、造血干细胞，制备免疫细胞药物或造血干细胞基因改造后表达功能正常蛋白用于基因治疗，已经有多款获批的免疫细胞药物和基因治疗药物。药品监管部门对于包装慢病毒的质粒系统、慢病毒载体，从药物安全性角度提出了指导原则；另外，作为产业化的药品，对于慢病毒载体的产量和基因改造的效率，需要满足低成本、工艺稳定、质量可控的药物产业化要求。
6、基于以上慢病毒载体的研究进展，药物监管部门对于慢病毒载体安全性的要求和作为药品生产的产业化要求，本专利技术提出了高效安全的三代载体四质粒慢病毒系统，经过质粒合成、质粒提取、慢病毒包装和car-t细胞制备，该慢病毒系统可以高效的包装出高滴度的慢病毒，能够成功的进行体外细胞基因改造。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种安全、高效，能够包装出高滴度的慢病毒，成功进行体外细胞基因改造的慢病毒包装系统。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供了一种慢病毒包装系统，所述的慢病毒包装系统为四质粒系统，包括穿梭质粒、包膜质粒、gag-pol包装质粒和rev包装质粒；所述的穿梭质粒将prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre的5'ltr的启动子的rsv换为cmv，将hpgk启动子换为ef1启动子，egfp基因替换为seq id no:5所示的序列，将氨苄抗性基因替换为卡那抗性基因，将驱动x蛋白转录的启动子剔除，起始密码atg的a变为t。
4、优选地，所述的穿梭质粒的序列如seq id no:1所示。
5、优选地，所述的包膜质粒的序列如seq id no:2所示。
6、优选地，所述的gag-pol包装质粒的序列如seq id no:3所示。
7、优选地，所述的rev包装质粒的序列如seq id no:4所示。
8、具体地，所述的穿梭质粒基于慢病毒质粒prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre(http://n2t.net/addgene:12252)的序列和骨架。
9、具体地，所述的穿梭质粒中含有cd19 car基因。
10、具体地，所述的包膜质粒由didier trono lab构建，存储于addgene，(https://www.addgene.org/12259/)。将其氨苄抗性基因替换为pet-28(a)质粒的卡那抗性基因。
11、具体地，所述的gag-pol包装质粒来源于质粒pmdlg-prre，由didier trono lab构建，存储于addgene(www.addgene.org/12251/)。
12、具体地，所述的gag-pol包装质粒包含gag基因和pol基因，gag基因编码p55蛋白前体，p55蛋白前体被蛋白酶裂解成p17、p24、p7、p6、p1和p2蛋白。pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶和核糖核酸酶h。
13、具体地，所述的rev包装质粒来源于质粒prsv-rev，由didier trono lab构建，存储于addgene(www.addgene.org/12253/)。
14、具体地，所述的rev包装质粒包含rev基因。rev基因编码rev蛋白，rev蛋白是所有慢病毒都具有的附属蛋白，rev是一种小的rna结合蛋白，对于将未完全剪切的mrna输出到细胞质，对病毒结构蛋白表达和病毒粒子组装都至关重要。
15、进一步具体地，所述的gag-pol包装质粒和rev包装质粒为卡那抗性基因。
16、优选地，所述的穿梭质粒、gag-pol包装质粒、rev包装质粒和包膜质粒的比例为7:5:5:3。
17、又一方面，本专利技术提供了一种慢病毒的构建方法，所述的构建方法为使用上述的慢病毒包装系统转染宿主细胞，得到慢病毒。
18、优选地，所述的慢病毒的构建方法包括以下步骤：
19、s1、将宿主细胞接种至培养基中培养，培养至活细胞密度为(4.5-8.0)×106cells/ml时进行慢病毒转染；
20、s2、将穿梭质粒、gag-pol包装质粒、rev包装质粒和包膜质粒共同瞬时转染至宿主细胞，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种慢病毒包装系统，其特征在于：所述的慢病毒包装系统为四质粒系统，包括穿梭质粒、包膜质粒、gag-pol包装质粒和rev包装质粒；所述的穿梭质粒将pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的5'LTR的启动子的RSV换为CMV，将hPGK启动子换为EF1启动子，EGFP基因替换为SEQ ID NO:5所示的序列，将氨苄抗性基因替换为卡那抗性基因，将驱动X蛋白转录的启动子剔除，起始密码ATG的A变为T。
2.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于，所述的穿梭质粒的序列如SEQID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的包膜质粒的序列如SEQID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的gag-pol包装质粒的序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的rev包装质粒的序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的穿梭质粒、ga
7.一种慢病毒的构建方法，其特征在于：所述的构建方法为使用权利要求1-6任意一项所述的慢病毒包装系统转染宿主细胞，得到慢病毒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：步骤S1和S2中所述的宿主细胞为293TS细胞。
10.权利要求1-6任意一项所述的慢病毒包装系统或权利要求7-9任意一项所述的构建方法构建得到的慢病毒在制备药物或疫苗中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的药物是工程化免疫细胞。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的工程化免疫细胞是CAR-T细胞。
13.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中包括权利要求1-6任意一项所述的慢病毒包装系统或权利要求7-9任意一项所述的构建方法构建得到的慢病毒。
...【技术特征摘要】
1.一种慢病毒包装系统，其特征在于：所述的慢病毒包装系统为四质粒系统，包括穿梭质粒、包膜质粒、gag-pol包装质粒和rev包装质粒；所述的穿梭质粒将prrlsin.cppt.pgk-gfp.wpre的5'ltr的启动子的rsv换为cmv，将hpgk启动子换为ef1启动子，egfp基因替换为seq id no:5所示的序列，将氨苄抗性基因替换为卡那抗性基因，将驱动x蛋白转录的启动子剔除，起始密码atg的a变为t。
2.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于，所述的穿梭质粒的序列如seqid no:1所示。
3.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的包膜质粒的序列如seqid no:2所示。
4.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的gag-pol包装质粒的序列如seq id no:3所示。
5.根据权利要求1所述的慢病毒包装系统，其特征在于：所述的rev包装质粒的序列如seq id no:4所示。
6.根据权利要求1-5任意...
【专利技术属性】
技术研发人员：张继帅，栗红建，王美玲，苏红昌，
申请(专利权)人：深圳普瑞金生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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