一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用，涉及生物医学技术领域。所述的NK细胞冻存液由CS10和人血清白蛋白组成；所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为(1

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种NK细胞冻存液及其冻存方法和应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是基于基因工程构造并表达于细胞表面的受体蛋白，由抗原识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区组成。自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)是人类先天免疫淋巴细胞，细胞表面含有一系列激活和抑制受体，可以快速识别并杀伤病变细胞。CAR
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NK疗法是基于基因工程改造的NK细胞的过继细胞疗法。其疗法能规避自体CAR
‑
T的许多缺点，如细胞因子释放综合征、与免疫相关的神经毒性综合征、可及性差等。CAR
‑
NK细胞制剂辅料的选择尤为重要，NK细胞的冻存与T细胞相比，一般损伤较大，需筛选合适的制剂处方，保证较好的活性。
[0003]CS10是一款无血清、无动物成分的冻存液，DMSO含量为10％。该冻存液已广泛应用于免疫细胞冻存，且有较好的冻存保护效果。FDA批准的第3款CD19导向CAR
‑
T细胞疗法Breyanzi，其制剂所用的处方为CS10，24％复方电解质，1％HSA。
[0004]DMSO Free GMP grade为GMP级完全冻存液，其为无色透明澄清液体，不含DMSO、血清及动物源成分，化学成分限定且安全。并已取得美国FDA的BMF(Biological Master File)登记号(MF#：19364)。该冻存液已显示出较好的冻存效果。
[0005]中国专利CN202211407542.1中公开了一种NK细胞冻存液及冻存方法，所述的NK细胞冻存液由冻存液A和冻存液B组成；所述的冻存液A包括以下体积百分比的组分：人血清白蛋白30
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60％、右旋糖酐10
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30％和海藻糖25
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45％；所述的冻存液B包括以下组分：忍冬提取物5
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10％、551
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H3培养基45
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50％、培养上清浓缩液4
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6％、羟乙基淀粉18
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20％和甘油21
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25％。该专利技术的NK细胞冻存液添加培养上清浓缩液，能够维持细胞冻存中和复苏后的细胞活性，无添加异源蛋白，避免外源蛋白给细胞带来的污染，同时将生物废料加以应用，大大节省了冻存成本。但是该NK细胞冻存液的组成成分复杂。
[0006]中国专利CN202010240894.7中公开了一种NK细胞冻存液，所述的NK细胞冻存液是在培养基中添加葡萄聚糖和多聚赖氨酸CPLL制成。该专利技术的NK细胞冻存液不包括动物和人源血清，防止了人畜共患传染病的潜在传播或引起同种异体反应的风险；加入的葡聚糖和CPLL不仅能减少冻存和复苏过程中冰晶对细胞的损伤，还能有效的保存细胞的杀伤活性。该专利技术的冻存液制备简单，安全，有很好的应用市场，但其复苏后细胞活率的下降幅度较大。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种NK细胞冻存液，本专利技术通过对NK细胞冻存液中各成分的种类及含量进行筛选，使得制备的NK细胞冻存液能够有效的保护细胞免受损伤，并且在冻
存和复苏过程中维持细胞的活性。
[0008]术语解释：
[0009]如本文所述，术语NK细胞又称为自然杀伤细胞，是人类先天免疫淋巴细胞。NK细胞具有抗病毒的作用，在其机体受到病毒感染时，不需要抗原刺激，就可以产生细胞因子、白细胞介素和干扰素等，对抗肿瘤的发生和病毒感染。NK细胞在肿瘤中起到很好的监视作用，会监视人体免疫寿命和肿瘤细胞的损伤情况等。NK细胞还能够调解人体免疫功能，防止产生自身免疫性疾病以及其他免疫功能的异常。
[0010]如本文所述，术语CS10是一种无血清、无动物成分的冻存液，DMSO含量为10％。
[0011]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0012]一方面，本专利技术提供了一种NK细胞冻存液，所述的NK细胞冻存液由CS10和人血清白蛋白(HSA)组成；
[0013]所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为(2
‑
4)：1。
[0014]优选地，所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为3：1。
[0015]优选地，所述的NK细胞为CAR
‑
NK细胞。
[0016]又一方面，本专利技术提供了一种NK细胞的冻存方法，采用上述的NK细胞冻存液对NK细胞进行冻存。
[0017]优选地，所述的冻存方法包括以下步骤：
[0018](1)将CS10和人血清白蛋白按照体积比进行混合，得NK细胞冻存液；
[0019](2)向NK细胞中加入NK细胞冻存液，得细胞悬液；
[0020](3)将细胞悬液分装于冻存管中并进行程序降温。
[0021]优选地，步骤(2)中所述的NK细胞的密度为3.00
×
107cells/ml
‑
1.00
×
108cells/ml。
[0022]进一步优选地，步骤(2)中所述的NK细胞的密度为4.00
×
107cells/ml
‑
6.00
×
108cells/ml。
[0023]最优选地，步骤(2)中所述的NK细胞的密度为5.00
×
107cells/ml。
[0024]优选地，步骤(2)中NK细胞为处理后的细胞，处理过程如下：将NK细胞悬液离心后弃上清得到所需的NK细胞。
[0025]进一步优选地，所述的离心的转速为400
‑
800g，离心的时间为8
‑
15min，离心的温度为2
‑
8℃；
[0026]再进一步优选地，所述的离心的转速为500g，离心的时间为10min，离心的温度为4℃。
[0027]优选地，步骤(3)中所述的程序降温如下(User1)：
[0028]a.在4.0℃等待，直至样品放入；
[0029]b.样品温度以1.0℃每分钟的速率降到
‑
4.0℃；
[0030]c.腔体温度以10.0℃每分钟的速率降到
‑
10.0℃；
[0031]d.腔体温度以0.5℃每分钟的速率降到
‑
20.0℃；
[0032]e.样品温度以1.0℃每分钟的速率降到
‑
80.0℃；
[0033]f.降温结束。
[0034]具体地，步骤(3)中所述的程序降温后将细胞悬液转移至液氮中保存。
[0035]优选地，使用上述的NK细胞冻存液冻存后的NK细胞复苏包括以下步骤：
[0036](1)配制NK细胞培养基；
[0037](2)取步骤(1)中培养基加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞冻存液，其特征在于，所述的NK细胞冻存液由CS10和人血清白蛋白组成；所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为(1
‑
5)：1。2.根据权利要求1所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为(2
‑
4)：1。3.根据权利要求2所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述的CS10和人血清白蛋白的体积比为3:1。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的NK细胞冻存液，其特征在于，所述的NK细胞为CAR
‑
NK细胞。5.一种NK细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1
‑
4任一项所述的NK细胞冻存液对NK细胞进行冻存。6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述的冻存方法包括以下步骤：(1)将CS10和人血清白蛋白按照体积比进行混合，得NK细胞冻存...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继帅，罗燕平，李剑梅，
申请(专利权)人：深圳普瑞金生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：