【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及改造的病毒载体、慢病毒及应用。
技术介绍
1、慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科慢病毒亚科。目前已上市的car-t，如kymriah、breyanzi、abecma、carvykti均使用慢病毒携带car基因转导t细胞。常用的慢病毒载体衍生自人类免疫缺陷病毒(hiv-1)，去除非必需基因和毒力基因，在安全性方面进行了一系列设计和改造，通常使用三代载体、四质粒系统包装慢病毒。原hiv-1的包膜蛋白env只能结合cd4分子，感染cd4阳性t细胞，作为基因传递工具的慢病毒，使用异源病毒包膜蛋白vsv-g替换env，可以进行假型的病毒包装。vsv-g通过结合ldlr受体，介导病毒内吞，具有广泛的亲嗜性，能够介导慢病毒内吞进入多种细胞类型。
2、慢病毒进行car基因改造t细胞，从工艺和质控方面已经非常成熟，然而，使用vsv-g包膜蛋白假型的慢病毒转导nk细胞，制备car-nk时，慢病毒的转导效率极低。t细胞活化后，vsv-g包膜蛋白假型的携带gfp的慢病毒可以使73％的t细胞转导成功，而nk细胞活化后，仅有2％的nk细胞可以被携带gfp的vsv-g包膜蛋白假型的慢病毒转导。慢病毒转导nk细胞的低效率阻碍了car-nk药物的研发和规模化生产。
3、文献报道，使用包膜蛋白rd114包装的逆转录病毒可以高效感染脐带血nk细胞，制备car-nk，经该工艺制备的脐带血靶向cd19的car-nk已经临床应用于11名b细胞肿瘤患者，具有73％(8/11)的反应率，其中7名患者完全缓解(
4、目前，亟需一种能够包装出高滴度的慢病毒，且能够高效感染nk细胞的病毒载体。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种能够高效包装出高滴度慢病毒、高效感染nk细胞的病毒载体。
2、为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
3、一方面，本专利技术提供了一种包膜蛋白，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如seqid no:2所示。
4、具体地，所述的包膜蛋白是基于baev的野生型氨基酸序列突变得到的。
5、进一步具体地，所述的baev的野生型氨基酸序列如seq id no:1所示。
6、再进一步具体地，所述的突变为将seq id no:1序列中编码r区的序列(vltqqyqvlrtdeeaqd)剔除。
7、又一方面，本专利技术提供了一种核酸，所述的核酸编码权利要求1所述的包膜蛋白。
8、优选地，所述的核酸的核苷酸序列如seq id no:3所示。
9、具体地，在seq id no:3所示的序列上添加终止密码“tag”，克隆入编码vsv-g包膜蛋白的质粒(pmd2.g-k)，完全替换vsv-g的开放读框(从起始密码到终止密码)，得到编码baevrdel的质粒(zl003-baevrdel)。
10、又一方面，本专利技术提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸在制备慢病毒中的应用。
11、又一方面，本专利技术提供了一种慢病毒的制备方法，所述的制备方法包含使用上述的包膜蛋白进行制备。
12、优选地，所述的制备方法还包括使用穿梭质粒、包装质粒pmdlg-prre-k和包装质粒prsv-rev-kana-v2进行制备。
13、进一步优选地，所述的穿梭质粒的序列如seq id no:6-7所示或如seq id no:10-11所示，所述的包装质粒pmdlg-prre-k的序列如seq id no:8所示，所述的包装质粒prsv-rev-kana-v2的序列如seq id no:9所示。
14、再进一步优选地，所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pmdlg-prre-k和包装质粒prsv-rev-kana-v2的比例为9:7:7:7。
15、具体地，所述的制备方法，包括以下步骤：
16、s1、将宿主细胞接种至培养基中培养，培养至活细胞密度为(4-6)×106cells/ml时进行慢病毒转染；
17、s2、将穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pmdlg-prre-k和包装质粒prsv-rev-kana-v2共同瞬时转染至宿主细胞，其中所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pmdlg-prre-k和包装质粒prsv-rev-kana-v2的比例为9:7:7:7；
18、s3、37℃培养48-72小时，收集慢病毒。
19、具体地，步骤s1中细胞活率大于90％。
20、具体地，步骤s1中培养至活细胞密度为5×106cells/ml时进行慢病毒转染。
21、优选地，步骤s1和步骤s2中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
22、进一步优选地，步骤s1和步骤s2中所述的宿主细胞选自人胚胎肾细胞(hek293)或293t细胞。
23、再进一步优选地，步骤s1和步骤s2中所述的宿主细胞为293ts细胞。
24、优选地，步骤s1中所述的培养基选自cho培养基、lb培养基、tb培养基、sob培养基中的一种或多种。
25、进一步优选地，步骤s1中所述的培养基为cho培养基。
26、再进一步优选地，步骤s1中所述的培养基为opm-cho pff06培养基。
27、具体地，步骤s3中转染的时间为48h。
28、又一方面，本专利技术提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸或上述的制备方法制备得到的慢病毒在感染nk细胞中的应用。
29、具体地，使用上述的慢病毒载体感染nk细胞的时间为48h。
30、又一方面，本专利技术提供了上述的包膜蛋白或上述的核酸或上述的制备方法制备得到的慢病毒在制备药物或疫苗中的应用。
31、优选地，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包膜蛋白，其特征在于，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的包膜蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸在制备慢病毒中的应用。
5.一种慢病毒的制备方法，其特征在于，所述的慢病毒通过权利要求1所述的包膜蛋白进行制备。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括使用穿梭质粒、包装质粒pMDLg-pRRE-K和包装质粒pRsv-rev-kana-V2制备慢病毒；所述的穿梭质粒的序列如SEQ IDNO:6-7所示或如SEQ ID NO:10-11所示，所述的包装质粒pMDLg-pRRE-K的序列如SEQ IDNO:8所示，所述的包装质粒pRsv-rev-kana-V2的序列如SEQ ID NO:9所示。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的穿梭质粒、包膜蛋白、包装质粒pMDLg-pRR
8.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求5-7任一项所述的制备方法制备得到的慢病毒在感染NK细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用慢病毒载体感染NK细胞的时间为48h。
10.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求5-7任一项所述的制备方法制备得到的慢病毒在制备药物或疫苗中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的药物是工程化免疫细胞。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的工程化免疫细胞是CAR-NK细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种包膜蛋白，其特征在于，所述的包膜蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的包膜蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的核苷酸序列如seq id no:3所示。
4.权利要求1所述的包膜蛋白或权利要求2-3任一项所述的核酸在制备慢病毒中的应用。
5.一种慢病毒的制备方法，其特征在于，所述的慢病毒通过权利要求1所述的包膜蛋白进行制备。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括使用穿梭质粒、包装质粒pmdlg-prre-k和包装质粒prsv-rev-kana-v2制备慢病毒；所述的穿梭质粒的序列如seq idno:6-7所示或如seq id no:10-11所示，所述的包装质粒pmdlg-prre-k的序列如seq idno:8所示，所述的包装质粒prsv-re...
【专利技术属性】
技术研发人员：张继帅，栗红建，苏红昌，罗燕平，
申请(专利权)人：深圳普瑞金生物药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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