【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞，具体涉及基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品。
技术介绍
1、干细胞是未成熟细胞，其未充分分化，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞治疗已在糖尿病、帕金森综合征、红斑狼疮、白血病等多种疾病中进行了相应治疗尝试。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，ipsc）的制备技术及其应用，将干细胞治疗带入了一个全新时代。随着分子生物学技术，特别是基因编辑技术的不断发展，基因修饰在干细胞治疗中发挥着越来越重要的作用。
2、干细胞治疗作为一种再生医学技术，旨在用具有特定功能的细胞替代功能异常细胞，恢复相应细胞功能，改善机体健康状态。目前有多种干细胞用于临床， 其中，hsc移植已改善多种免疫系统和血液系统疾病的预后，如先天性免疫缺陷、多发性骨髓瘤、地中海贫血等。研究数据表明，异体hsc的植入可将r/raml（idh1/idh2突变的急性髓系白血病）患者的4年生存率提高至20%~35%。此外，msc因具有一定的免疫调节功能，被用于治疗免疫性疾病，如移植物抗宿主病等，取得了一定疗效。现有技术中已经公开了用于治疗腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷病（ada-scid）的自体hsc药物strimvelis及用于治疗阿尔茨海默病的自体msc药物astrostem。
3、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，msc）是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像apsc多能细胞。在胚胎发育中来源于
4、il-17为宿主保护粘膜感染的关键细胞因子，也是多种自身免疫和炎症性疾病的主要致病细胞因子和药物靶标。il-17家族包括六个成员：il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e和il-17f，各成员皆通过il-17受体（il-17ra至il-17re）介导其生物学功能。其中研究最多的il-17家族成员是il-17a，其通过与il-17ra和il-17rc结合来促进其生物活性。现有技术已经公开了il-17a在人类疾病中的病理作用的研究最终导致了针对il-17a（il-17a和il-17f、il-17ra或il-23）的单克隆抗体（mab）的开发。
5、研究il-17与干细胞的作用方式的现有技术如公开号为cn105079792a的中国专利申请，其公开了il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。具体地本专利技术提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂用于制备制剂或试剂盒的用途，用于提高间充质干细胞的免疫抑制功能；上调间充质干细胞中免疫抑制因子的表达；增强免疫抑制因子的mrna的稳定性；降低rna结合蛋白auf1的表达水平；抑制t细胞的增殖；治疗肝炎或肝损伤。
6、但现有技术中未有公开il-17相关抗体对干细胞的修饰，特别是il-17a特异性串联抗体在干细胞修饰中的作用。
7、本专利技术人致力于抗il-17a抗体开发，为便于审查，现对研发项目的技术背景进行简要介绍：
8、专利技术人基于筛选出的9个单域抗体（已另案申请），进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合（已另案申请）。
9、本专利技术在上述技术方案的基础上，继续进行技术开发，研发了单域抗体组合基因修饰干细胞技术，基于专利法单一性的相关规定，对多个不同的基因修饰干细胞分别请求保护，本案系基因修饰干细胞技术之一所进行的专利技术专利申请。
10、为便于理解本专利技术，可选地参阅本项目其他专利申请文件。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种修饰干细胞，基于免疫羊驼进行筛选，得到了多种具有il-17a特异性结合能力的纳米抗体，并选择了其中的两种进行串联，以实现干细胞修饰制备本专利技术目的的基因修饰干细胞。
2、本专利技术的干细胞，表达和/或分泌：
3、（1）第一抗体，所述的第一抗体包含特异性识别il-17a的单域抗体；和
4、（2）第二抗体，所述的第二抗体包含特异性识别il-17a的单域抗体；
5、所述的第一抗体和第二抗体的氨基酸序列不同。
6、所述的第一抗体包含序列如seq id no: 1-3所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3；和/或；与seq id no: 1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；
7、seq id no: 1：gekldyfa；
8、seq id no: 2：vtssgsst；
9、seq id no: 3：astillcsdyisafgt。
10、所述的第二抗体包含序列如seq id no: 4-6所示的hcdr4、hcdr5、hcdr6；和/或；与seq id no: 4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；
11、seq id no: 4：gfsihiya；
12、seq id no: 5：itrggvt；
13、seq id no: 6：naggtnggy。
14、本领域技术人员知晓，cdr区是抗体特异性识别抗原的区域，具到主要的结合活性，因此，本领域技术人员根据本专利技术记载的cdr区，理论上可以设计出多种抗体或融合蛋白进行应用。如采用纳米抗体的形式。
15、可选择地，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接，作为优选可以通过连接子连接。
16、优选地，所述的第一抗体和第二抗体通过连接子连接，所述的连接子为（ggggs）n，所述的n为≥1的整数，进一步优选为3。
17、优选地，所述干细胞包含、表达和/或分泌：
18、（1）第一蛋白，所述的第一蛋白的结构包含：
19、fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4；
20、（2）第二蛋白，所述的第二蛋白的结构包含：
21、fr5-hcdr4-fr6-hcdr5-fr7-hcdr6-fr8；
22、hcdr1-6选自seq id no: 1-6所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 1-6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；
23、fr1-8选自seq id no: 7-14所示的氨基酸序列；或；与seq id no: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列。
24、seq id no:7：qvqlvesggglvqpggslrlscaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种基于纳米抗体基因修饰的干细胞，其特征在于，包含、表达或分泌第一抗体和第二抗体，所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO: 1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO: 4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述第一抗体的结构包含：FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；
3. 根据权利要求2所述的干细胞，其特征在于，所述的第一抗体的序列包含如SEQ IDNO: 16所示的氨基酸序列；所述的第二抗体的序列包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接；所述的连接子包括SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
5. 根据权利要求4所述的干细胞，其特征在于，包含、表达和/或分泌融合蛋白，所述的融合蛋白的序列包含如SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17-SEQ
6.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，包括：编码第一抗体的核酸分子1和编码第二抗体的核酸分子2。
7. 根据权利要求6所述的干细胞，其特征在于，所述的核酸分子1和核酸分子2之间由编码包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的核苷酸序列连接。
8. 根据权利要求7所述的干细胞，特征在于，所述的核酸分子1编码包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述的核酸分子2编码包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
9. 根据权利要求8所述的干细胞，其特征在于，包括核酸分子3，所述的核酸分子3包括编码如SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:26所表示的氨基酸序列的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，还包含、表达或分泌能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。
11.根据权利要求10所述的干细胞，其特征在于，包含编码能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的干细胞，其特征在于，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。
13.根据权利要求1-12任意一项所述的干细胞，其特征在于，选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞。
14.一种细胞培养物，其特征在于，所述细胞培养物经根据权利要求1-13中任意一项所述的干细胞经培养获得。
15.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1-13中任意一项所述的干细胞或权利要求14所述的细胞培养物。
16.一种试剂盒，其特征在于，其包括根据权利要求1-13中任一所述的干细胞或权利要求14所述的细胞培养物。
17.一种权利要求1-13中任一所述的干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将核酸分子通过病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染导入干细胞；所述的核酸分子中包括编码第一抗体的核酸分子1和编码第二抗体的核酸分子2。
18.一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1. 一种基于纳米抗体基因修饰的干细胞，其特征在于，包含、表达或分泌第一抗体和第二抗体，所述的第一抗体包含序列如seq id no: 1-3所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3；所述的第二抗体包含序列如seq id no: 4-6所示的hcdr4、hcdr5、hcdr6。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述第一抗体的结构包含：fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4；
3. 根据权利要求2所述的干细胞，其特征在于，所述的第一抗体的序列包含如seq idno: 16所示的氨基酸序列；所述的第二抗体的序列包含如seq id no: 17所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接；所述的连接子包括seq id no: 15所示的氨基酸序列。
5. 根据权利要求4所述的干细胞，其特征在于，包含、表达和/或分泌融合蛋白，所述的融合蛋白的序列包含如seq id no:16-seq id no:15-seq id no:17-seq id no: 26所表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，包括：编码第一抗体的核酸分子1和编码第二抗体的核酸分子2。
7. 根据权利要求6所述的干细胞，其特征在于，所述的核酸分子1和核酸分子2之间由编码包含seq id no: 15所示的氨基酸序列的核苷酸序列连接。
8. 根据权利要求7所述的干细胞，特征在于，所述的核酸分子1编码包含seq id no:16所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述的核酸分子2编码包含seq id no: 17所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
9. 根据权利要求8所述的干细胞，其特征在于，包括核酸分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘广洋，刘拥军，张晨亮，李欣，王荷蕊，徐利强，
申请(专利权)人：北京贝来药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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