【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞免疫学，具体涉及纳米抗体串联体、编码基因及应用。
技术介绍
1、il-17是具有广谱促炎效应的细胞因子，通过激活dcs、单核和中性粒细胞浸润诱导和调节炎性th17细胞应答。il-17家族包括il-17a～il-17f以及受体il-17ra、il-17rc等，不同组织局部的不同il-17分子与其相应受体作用，发挥不同的促炎作用。其中il-17a的分布最广，il-17a的细胞来源主要有3种，包括适应性免疫细胞cd4+th17、固有免疫的γδt细胞和固有样淋巴细胞3(ilc3s)，il-17a可通过激活t细胞和其他免疫细胞产生各种炎性反应，导致机体自身免疫紊乱，在诸如系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)和多发性硬化(ms)、银屑病(psoriasis)等自身免疫性疾病中均发挥重要作用。
2、il-17a可作用于纤维母细胞、上皮细胞以及巨噬细胞，诱导多种炎症前因子及趋化因子例如cxcl1、ccl2、ccl7、ccl20以及基质金属蛋白酶(mmp)等的表达。il-17a还可以通过介导聚集中性粒细胞和巨噬细胞来参加炎症发生。在一些自身免疫性疾病的研究中，通过阻断il-17a，可以减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度(park,h.,et al.,adistinct lineage of cd4 tcells regulates tissue inflammation by producinginterleukin 17.nat immunol,2005.6(11):1133-41)。
4、中国专利cn103936854b中公开了一种抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用，该专利中还包含编码所述抗体的多核苷酸序列的表达载体，宿主细胞，以及单克隆抗体用于制备治疗由il-17a介导的免疫系统疾病中的用途。该专利技术从全合成噬菌体抗体库中筛选出抗il-17a单克隆抗体，然后用一种构建小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的方法，对筛选出的抗il-17a单克隆抗体的重链可变区cdr3区突变建库进行抗体体外亲和力成熟，最终获得高亲和力的抗体，同时增加了抗体库的多样性。但单克隆抗体具有一定的缺点，生产成本高，会产生耐药性，并且可能会出现机会性感染和毒性。
5、单域抗体(sdab)与常规的单克隆抗体不同，单域抗体缺少轻链，并且重链的可变区与铰链区之间没有ch1区，只有重链的可变区(vhh)和两个常规的ch2和ch3区。单域抗体的分子质量仅为传统抗体的十分之一，是最小的功能性抗原结合片段，由于其分子尺寸小，能够穿透到细胞间隙和组织中，并且能够穿过血脑屏障并在中枢神经系统中发挥作用。单域抗体的结构稳定，并且免疫原性低，易于人源化改造。单域抗体的cdr3较长，与抗原的结合方式更加灵活。
6、对于自身免疫性疾病临床可用的特效药物较少，单克隆抗体治疗存在一定的缺陷。因此，亟需开发一种稳定性高、亲和力强、制备方法简单、生产成本低的单域抗体类的药物。
7、本专利技术人致力于抗il-17a抗体开发，基于筛选出的9个单域抗体(已另案申请)，进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合，基于专利法单一性的相关规定，对12个不同单域抗体组合分别请求保护。
8、本专利技术是针对上述12个单域抗体组合抗体之一所进行的专利申请。
9、本专利技术人还基于以上，开发了基因修饰干细胞技术以及后续的应用技术，基于专利法单一性的相关规定，对3个不同的基因修饰干细胞以及3项不同的应用分别请求保护。
10、为便于理解本专利技术技术方案，可选地参阅本项目其他专利申请文件。
技术实现思路
1、本专利技术的术语和声明：
2、1、如本文所用，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名法委员会(biochemicalnomenclature commission)所推荐的单字母符号来提及。
3、2、如本文所用，术语“抗体”：指特异性结合和识别抗原的包括免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意指包含全抗体和其抗原结合片段。术语抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。
4、3、如本文所用，术语“单域抗体(vhh)”、“单域抗体”(singledomain antibody,sdab，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(vhh)。“本专利技术单域抗体”、“本专利技术的抗il-17a单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于il-17a的单域抗体。
5、4、如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，为了进行比较的目的，这些位置可能会被对齐。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。
6、5、如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。
7、6、如本文所用，术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。
8、7、如本文所用，术语“核酸分子”可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本专利技术中的核苷酸分子全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法或人工合成的方法获得。
9、8、如本文所用，术语“核苷酸序列”是指dna或rna中碱基的排列顺序，即在dna中为a、t、g、c的排列顺序，或者在mrna中a、u、g、c的排列顺序，也包括rrna、trna、mrna中碱基的排列顺序。
10、9、如本文所用，术语“框架区”即骨架区，在免疫球蛋白的h和l链的近n端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包含第一单域抗体和第二单域抗体；
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：通过在SEQID NO:1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：与SEQ IDNO:1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于：所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；
6.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包括：
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR
8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接；或；通过连接子间接连接。
9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于：所述连接子为(GGGGS)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(GGGGS)3。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为抗IL-17A抗体。
12.一种重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白包含权利要求1-11任意一项所述的抗体。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白，其特征在于：所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的重组蛋白，其特征在于：所述的免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；
16.一种药物偶联物，其特征在于：所述的药物偶联物包括：
17.一种抗体制剂，其特征在于：所述的抗体制剂包括：
18.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1-11任意一项所述的抗体或权利要求12-15任意一项所述的重组蛋白或权利要求17所述的抗体制剂；
19.一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白。
20.一种表达载体，其特征在于：所述的表达载体包含权利要求19所述的核酸分子。
21.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物、权利要求17所述的抗体制剂、权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的表达载体；
22.权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物、权利要求17所述的抗体制剂或权利要求21所述的药物组合物的用途，其特征在于：所述的用途为以下用途中的至少一种：
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于：所述自身免疫性疾病包括银屑病、类风湿关节炎、卡斯尔曼病、恶性类风湿关节炎、血管炎、自身免疫性肝炎、脊椎关节炎、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、恶性贫血、艾迪生病、局灶性硬皮病、特发性艾迪生病、炎症性肠病、结节病、妊娠疱疹、多发性肌炎、巴塞杜病、成人斯蒂尔病、系统性红斑狼疮、视神经脊髓炎、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、皮肌...
【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包含第一单域抗体和第二单域抗体；
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：通过在seqid no:1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：与seq idno:1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于：所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；
6.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包括：
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述的hcdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述的hcdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述的hcdr3的氨基酸序列如seq idno:3所示，所述的hcdr4的氨基酸序列如seq id no:4所示，所述的hcdr5的氨基酸序列如seq id no:5所示，所述的hcdr6的氨基酸序列如seq id no:6所示。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接；或；通过连接子间接连接。
9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于：所述连接子为(ggggs)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(ggggs)3。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从n端到c端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从c端到n端的顺序连接。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为抗il-17a抗体。
12.一种重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白包含权利要求1-11任意一项所述的抗体。
13.根据权利要求12所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。
14.根据权利要求13所述的重组蛋白，其特征在于：所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、his标签、gst标签、mbp标签、flag标签和sumo标签中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的重组蛋白，其特征在于：所述的免疫球蛋白fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；
16.一种药物偶联物，其特征在于：所述的药物偶联物包括：
17.一种抗体制剂，其特征在于：所述的抗体制剂包括：
18.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1-11任意一项所述的抗体或权利要求12-15任意一项所述的重组蛋白或权利要求17所述的抗体制剂；
19.一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘拥军，刘广洋，米一，陈瑶瑶，周敬文，徐利强，
申请(专利权)人：北京贝来药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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