【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程。
技术介绍
1、卡拉胶(carrageenan)作为一种结构独特的天然海洋硫酸多糖，由d-半乳糖通过交替的α-1,3和β-1,4糖苷键连接而成，由于卡拉胶粘度较高，不易被人体吸收，这极大地限制了卡拉胶的应用。卡拉胶寡糖(carrageenan oligosaccharide)是卡拉胶的降解产物，研究发现，其活性较卡拉胶有显著提高，而且其物理性能也得到明显改善，卡拉胶寡糖分子量相较于卡拉胶大大减小，这使得其溶解性以及抗氧化、抗病毒、免疫调节等多种生物活性得到了提升，在一定程度上拓宽了卡拉胶的应用范围。目前，制备卡拉胶寡糖的方法主要有物理法、化学法和酶法。
2、酶法制备卡拉胶寡糖具有条件温和、反应特异性强、环境污染少等优点，逐渐取代了传统的制备卡拉胶寡糖的方法。但是，从自然界分离的菌株直接发酵生产卡拉胶酶存在产量低、培养条件复杂、产酶不稳定、酶纯化成本高等问题。因此，采用基因工程方法对从自然界分离的卡拉胶酶基因进行异种表达，以提高卡拉胶酶的表达量，对于大规模制备卡拉胶酶和实现卡拉胶寡糖的产业化具有重要意义。根据底物专一性的不同，卡拉胶酶(carrageenanase)可分为κ-卡拉胶酶、ι-卡拉胶酶、λ-卡拉胶酶。在实际应用中，κ-卡拉胶酶(κ-carrageenanse,简称cgka酶)应用较多，但是目前κ-卡拉胶酶制备仍面临两个方面的问题：1)重组κ-卡拉胶酶大多以胞内酶的形式分泌表达，粗酶的制备必须进一步破碎处理后再离心获得，这在实
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种胞外高效分泌表达κ-卡拉胶酶的重组枯草芽孢杆菌，建立了更安全的食品级表达体系，实现了κ-卡拉胶酶的异源胞外分泌表达。
2、本专利技术的第一个目的是提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的κ-卡拉胶酶。
3、在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌bacillus subtiliswb600为宿主。
4、在一种实施方式中，氨基酸序列如seq id no.1所示的κ-卡拉胶酶是通过删除zobellia galactanivorans来源的野生型κ-卡拉胶酶的信号肽序列得到的；所述zobelliagalactanivorans来源的野生型κ-卡拉胶酶的氨基酸序列如seq id no.5所示，编码所述野生型κ-卡拉胶酶的信号肽的核苷酸序列如seq id no.4所示。
5、在一种实施方式中，所述κ-卡拉胶酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、在一种实施方式中，所述表达所使用的载体为可以在所述重组枯草芽孢杆菌内自主复制的质粒，所述质粒包括但不限于质粒pp43nmk。
7、在一种实施方式中，所述质粒pp43nmk的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、本专利技术的第二个目的是提供一种生产κ-卡拉胶酶的方法，所述方法包括应用上述重组枯草芽孢杆菌进行发酵的步骤。
9、在一种实施方式中，所述的发酵为，将所述重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，再按照1％-5％(v/v)的接种量将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养。
10、在一种实施方式中，所述的发酵为，将所述重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，将种子液以1％-5％(v/v)的接种量转接至装有50ml发酵培养基的250ml锥形瓶中。
11、在一种实施方式中，所述种子液接种量优选为4％(v/v)。
12、在一种实施方式中，所述种子培养基的组成包括：酵母粉2～8g/l，胰蛋白胨5～15g/l，nacl 5～15g/l。
13、在一种实施方式中，所述种子培养基的ph为6.5～7.5。
14、在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成包括：胰蛋白胨5～10g/l，酵母粉25～35g/l，k2hpo4 15～20g/l，kh2po4 1～3g/l，甘油5～10g/l。
15、在一种实施方式中，所述发酵培养基的ph为7～8。
16、在一种实施方式中，所述发酵培养的条件为20～37℃、180～280r/min。优选为25℃、180～280r/min。
17、在一种实施方式中，所述发酵培养的培养时间为12～96h。
18、本专利技术的第三个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌或所述方法在食品领域中的应用。
19、在一种实施方式中，所述应用包括所述重组枯草芽孢杆菌或所述方法在κ-卡拉胶寡糖制备中的应用。
20、本专利技术的有益效果：
21、本专利技术发现，野生型κ-卡拉胶酶(zobellia galactanivorans来源)并不能在枯草芽孢杆菌中实现异源胞外分泌表达，野生型κ-卡拉胶酶胞外活力检测不到酶活力，本专利技术通过去除野生型κ-卡拉胶酶的信号肽序列，实现了其在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌表达，最高酶活力为458.89u/ml。
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1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的κ-卡拉胶酶。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600为宿主。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的表达以质粒pP43NMK为表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种生产κ-卡拉胶酶的方法，所述方法包括应用权利要求1-3任一所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：将所述重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，再按照1％-5％(v/v)的接种量将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组成包括：酵母粉2～8g/L，胰蛋白胨5～15g/L，NaCl 5～15g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：胰蛋白胨5～10
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为20～37℃。
9.权利要求1-3任一所述重组枯草芽孢杆菌，或权利要求4-8任一所述的方法在食品领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括所述重组枯草芽孢杆菌或所述方法在κ-卡拉胶寡糖制备中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了氨基酸序列如seq id no.1所示的κ-卡拉胶酶。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis wb600为宿主。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的表达以质粒pp43nmk为表达载体，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.一种生产κ-卡拉胶酶的方法，所述方法包括应用权利要求1-3任一所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：将所述重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液，再按照1％-5％(v/v)的接种量将种子液转接至...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兆丰，孙虹，黄敏，陈双娣，王璐潇，顾正彪，李才明，班宵逢，
申请(专利权)人：宜兴食品与生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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