【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效生产3-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用，属于生物。
技术介绍
1、人乳低聚糖(human milk oligosaccharides，hmos)是母乳中特有的复合碳水化合物，作为母乳中第三大固体成分，对新生儿的生长发育具有非常重要的作用。根据组成hmos的单糖结构单元，hmos可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖和中性非岩藻糖基化乳糖三种。其中，中性岩藻糖基乳糖约占50％，而3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)作为其中重要的组分之一，在医药、食品、奶粉等行业应用前景广阔，具有抗菌活性，能有效保护肠道上皮细胞，增强肠道屏障功能，同时能参与免疫调节，以及促进婴幼儿大脑发育，改善学习能力的功能。目前，3-fl已被美国食品和药物管理局(fda)批准为安全的食品添加剂，可作为新型婴幼儿配方食品中的营养添加剂。
2、目前，3-fl的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和生物合成法。在化学合成法中，需要使用一些有毒的化学试剂，步骤繁琐，不仅使得后续纯化成本达，且会对环境造成一定的污染。而相较绿色环保的酶法合成，3-fl的催化合成需要昂贵的gdp-l-岩藻糖作为前体，生产成本较高。生物合成法是利用廉价的底物，在细胞内代谢合成gdp-l-岩藻糖，并在α-1,3-岩藻糖基转移酶的作用下合成3-fl。因此，生物合成法具有更好的工业应用前景，受到越来越多研究者的青睐。例如，研究者利用甘油作为底物，通过表达合成3-fl的途径酶，可以实现在大肠杆菌(echerichia coli)中合成
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术通过代谢流的基础改造，再将无序蛋白与途径中的关键酶联系起来，提高微生物发酵生产3-fl的产量。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括以下改造：敲除了葡萄糖特异性pts酶iibc组分基因ptsg、β-半乳糖苷水解酶基因lacz、转录阻遏物基因laci、6-磷酸果糖激酶1基因pfka、十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaj、蛋白lon基因lon、gdp-甘露糖甘露糖醇水解酶基因nudd，过表达了α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2和乳糖渗透酶基因lacy，且至少有一个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2上融合有sumo标签，强化表达dna结合转录激活蛋白基因rcsa，并表达了分别融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manb和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manc，以及融合第二互作短肽的无序蛋白fusn或rgg；
3、所述第一互作短肽和第二互作短肽可特异性结合。
4、进一步地，在基因组上整合α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2、乳糖渗透酶基因lacy，采用质粒表达融合第一互作短肽的磷酸甘露糖变位酶基因manb和α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manc，以及融合第二互作短肽的无序蛋白fusn或rgg。
5、进一步地，过表达α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2为，在基因组上整合至少四个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2。
6、进一步地，分别在运动蛋白基因mota位点、鞭毛驱动蛋白基因flir位点以及三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因apti位点替换入α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2，并在thrw位点整合含有sumo标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2。
7、进一步地，过表达乳糖渗透酶基因lacy为，在基因组上整合至少一个拷贝的乳糖渗透酶基因lacy，和/或采用组成型强启动子替换乳糖渗透酶基因lacy的原启动子。
8、进一步地，强化表达dna结合转录激活蛋白基因rcsa为，采用组成型强启动子替换dna结合转录激活蛋白基因rcsa的原启动子。
9、进一步地，本专利技术中组成型强启动子包括但不限于ptac启动子。
10、进一步地，第一互作短肽和第二互作短肽包括但不限于：短肽riad和短肽ridd、短肽cc-di-a和短肽cc-di-b。
11、进一步地，当第一互作短肽为短肽riad时，第二互作短肽为短肽ridd；当第一互作短肽为短肽ridd时，第二互作短肽为短肽riad。
12、进一步地，当第一互作短肽为短肽cc-di-a时，第二互作短肽为短肽cc-di-b；当第一互作短肽为短肽cc-di-b时，第二互作短肽为短肽cc-di-a。
13、进一步地，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2与sumo标签通过柔性连接肽连接，序列如seq id no.14所示。
14、进一步地，葡萄糖特异性pts酶iibc组分基因ptsg的gene id:945651，β-半乳糖苷水解酶基因lacz的gene id:945006，转录阻遏物基因laci的geneid:945007，6-磷酸果糖激酶1基因pfka的gene id:948412，十一烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶基因wcaj的gene id:946583，蛋白lon基因lon的gene id:945085，gdp-甘露糖甘露糖醇水解酶基因nudd的geneid:946559。
15、进一步地，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2的核苷酸序列如seq id no.1所示，乳糖渗透酶基因lacy的核苷酸序列如seq id no.7所示，dna结合转录激活蛋白基因rcsa的核苷酸序列如seq id no.13所示。
16、进一步地，磷酸甘露糖变位酶基因manb的核苷酸序列如seq id no.15所示，α-甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因manc的核苷酸序列如seq id no.16所示。
17、进一步地，无序蛋白fusn的核苷酸序列如seq id no.17所示，无序蛋白rgg的核苷酸序列如seq id no.18所示。
18、进一步地，短肽riad的核苷酸序列如seq id no.19所示，短肽ridd的核苷酸序列如seq id no.20所示。
19、进一步地，短肽cc-di-a的氨基酸序列如seq id no.21所示，短肽cc-di-b的氨基酸序列如seq id no.22所示。
20、进一步地，以大肠杆菌k12 mg1655为宿主菌。
21、进一步地，上述重组大肠杆菌的构建方法包括以下步骤：
22、s1、构建包含运动蛋白基因mota位点的上下游同源臂、ptac启动子和α1,3-岩藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含ptarget质粒共同转入带有pcas9质粒的大肠杆菌k12 mg1655感受态中，构建重组大肠杆菌k12mg1655△mota::futm2；所述的ptarget质粒包含运动蛋白基因mota的n20序列的sgrna，所述的pcas9质粒用于表达cas9蛋白；
23、s2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括以下改造：
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2为，在基因组上整合至少四个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，分别在运动蛋白基因motA位点、鞭毛驱动蛋白基因fliR位点以及三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因aptI位点替换入α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2，并在thrW位点整合含有SUMO标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达乳糖渗透酶基因lacY为，在基因组上整合至少一个拷贝的乳糖渗透酶基因lacY，和/或采用组成型强启动子替换乳糖渗透酶基因lacY的原启动子。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，强化表达DNA结合转录激活蛋白基因rcsA为，采用组成型强启动子替换DNA结合转录激活蛋白基因rcsA的原启动子。
6.根据权利要求4或5所述的重组大
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，第一互作短肽和第二互作短肽的组合选自短肽RIAD和短肽RIDD、短肽CC-Di-A和短肽CC-Di-B中的任一种。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，
9.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，α1,3-岩藻糖基转移酶基因futM2与SUMO标签通过柔性连接肽连接。
10.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌K12MG1655为宿主菌。
11.一种生产3-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，采用权利要求1-10任一项所述重组大肠杆菌进行发酵生产。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括胰蛋白胨9-12g/L、酵母粉4-7g/L，NaCl 9-12g/L。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨12-15g/L、酵母粉22-30g/L、磷酸二氢钾2.2-2.5g/L、磷酸氢二钾11-13g/L。
15.权利要求1-10任一项所述的重组大肠杆菌在制备食品添加剂中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述食品包括婴幼儿食品。
...【技术特征摘要】
1.一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括以下改造：
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2为，在基因组上整合至少四个拷贝的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，分别在运动蛋白基因mota位点、鞭毛驱动蛋白基因flir位点以及三磷酸腺苷合成酶辅助因子基因apti位点替换入α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2，并在thrw位点整合含有sumo标签的α1,3-岩藻糖基转移酶基因futm2。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，过表达乳糖渗透酶基因lacy为，在基因组上整合至少一个拷贝的乳糖渗透酶基因lacy，和/或采用组成型强启动子替换乳糖渗透酶基因lacy的原启动子。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，强化表达dna结合转录激活蛋白基因rcsa为，采用组成型强启动子替换dna结合转录激活蛋白基因rcsa的原启动子。
6.根据权利要求4或5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述组成型强启动子包括ptac启动子。
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，黄子洋，黄慧源，
申请(专利权)人：宜兴食品与生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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