【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开尤其涉及多核苷酸的测序。
技术介绍
1、模板多核苷酸链的测序可通过多个步骤循环发生，其中每个循环一个可检测核苷酸被掺入与模板链互补的拷贝链中。可检测核苷酸通常被封闭以防止每个循环掺入多于一个可检测核苷酸。在孵育时间后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入拷贝链中的可检测核苷酸的身份。接着，进行去封闭步骤和裂解或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后一个掺入的核苷酸中去除封闭剂，并且从掺入拷贝链中的最后一个核苷酸裂解可检测部分或在该核苷酸上掩蔽可检测部分。在一些情况下，去除封闭部分的步骤也去除可检测部分。然后通过在掺入步骤中引入封闭的、可检测核苷酸来重复该循环。
2、测序循环的每个步骤都采用不同的组合物。例如，在掺入步骤期间采用包含聚合酶和核苷酸的掺入组合物。扫描组合物尤其可以包括抗氧化剂，该抗氧化剂在检测步骤期间保护多核苷酸免受光诱导的损伤，例如，当核苷酸包含用于检测的荧光团标记时。在去封闭步骤期间采用去封闭组合物，该去闭组合物包含用于从所掺入的核苷酸中裂解封闭部分的试剂。可在去封闭步骤之后使用可包含清除剂化合物的裂解后洗涤组合物，以保护多核苷酸、酶或其他测序试剂免受去封闭步骤中使用或产生的反应性化合物的影响。
3、通常使用大量的试验以及误差和考虑来开发每个测序步骤中使用的组合物和试剂，以减少测序中的误差，增加测序速率，增加可进行的测序循环的数目，直至先前掺入的核苷酸的身份不再能被可靠地确定等。尽管在开发测序试剂和组合物时小心，但仍存在一些问题。例如，来自先前掺入
技术实现思路
1、本公开尤其描述了使用包含聚合酶的洗涤组合物的多核苷酸测序方法。令人惊奇的是，已经发现在洗涤组合物中使用聚合酶减少了去封闭步骤之后的残留信号。甚至更令人惊奇的是，在洗涤组合物中掺入聚合酶可改善其他测序度量，诸如减少定相、预定相、误差率和信号衰减中的一者或多者。在洗涤组合物中使用聚合酶还可允许较短的测序循环时间。例如，在洗涤组合物中使用聚合酶可允许减少掺入步骤的持续时间。
2、尽管未完全理解关于包含聚合酶的洗涤组合物如何减少残留信号的机制，但洗涤组合物中的聚合酶(“第二”聚合酶)有可能促进测序聚合酶(“第一”聚合酶)从拷贝链或模板链的去除。第一聚合酶可接受或保留裂解的可检测部分。因此，去除结合的第一聚合酶可引起残留信号的减少。如果包含第二聚合酶的洗涤组合物促进结合的第一聚合酶的去除，则在去封闭步骤之前或之后使用洗涤组合物可减少残留信号。
3、已理解或还未充分理解关于包含聚合酶的洗涤组合物如何可减少定相和预定相以及如何可影响其他测序度量的一种或多种机制。不考虑所涉及的一种或多种机制，使用包含聚合酶的洗涤组合物可令人惊奇地为测序提供益处。
4、在本文所述的一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括：(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得该聚合酶将该多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与该模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；(b)识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸；(c)从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；(d)用包含第二聚合酶的第一洗涤组合物将去除的标记和该封闭部分从该拷贝多核苷酸链上洗去；以及(e)重复步骤(a)至(d)直至确定该模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
5、在本文所述的一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括：(a)将包含第一聚合酶和多个封闭的、标记的核苷酸的掺入组合物与模板多核苷酸链一起孵育，使得该聚合酶将该多个封闭的、标记的核苷酸之一掺入与该模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中；(b)识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸；(c)使掺入了该封闭的、标记的核苷酸的该拷贝多核苷酸链与包含第二聚合酶的第一洗涤组合物接触；(d)从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分；(e)用第二洗涤组合物将去除的标记和该封闭部分从该拷贝多核苷酸链上洗去；以及(f)重复步骤(a)至(e)直至确定该模板多核苷酸链的至少部分序列为止。
6、第一聚合酶和第二聚合酶可以是相同的聚合酶或可以是不同的聚合酶。
7、第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。例如，第一洗涤组合物可基本上不含镁离子(mg2+)。除了第一洗涤组合物基本上不含mg2+之外，第一洗涤组合物可与掺入组合物基本上相同。
8、在本文所述的一些实施方案中，与测序设备一起使用的盒包括：(a)第一室，该第一室含有掺入组合物，该掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；(b)第二室，该第二室含有用于识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；(c)第三室，该第三室含有裂解组合物，该裂解组合物包含用于从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及(d)第四室，该第四室含有第一洗涤组合物，该第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中该第一洗涤组合物被配置为防止第二聚合酶将该多种核苷酸之一掺入该拷贝多核苷酸链中。
9、第一聚合酶和第二聚合酶可以是相同的聚合酶或可以是不同的聚合酶。
10、第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合酶将核苷酸掺入拷贝多核苷酸链中。例如，第一洗涤组合物可基本上不含镁离子(mg2+)。除了第一洗涤组合物基本上不含mg2+之外，第一洗涤组合物可与掺入组合物基本上相同。
11、该盒可包括含有第二洗涤组合物的第五室。第二洗涤组合物可基本上不含聚合酶和核苷酸。
12、在本文所述的一些实施方案中，与测序设备一起使用的试剂盒包括：(a)第一容器，该第一容器含有掺入组合物，该掺入组合物包含用于将封闭的、标记的核苷酸掺入与模板多核苷酸链的至少一部分互补的拷贝多核苷酸链中的第一多种试剂；(b)第二容器，该第二容器含有用于识别掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸的检测组合物；(c)第三容器，该第三容器含有裂解组合物，该裂解组合物包含用于从掺入该拷贝多核苷酸链中的该封闭的、标记的核苷酸中去除标记和封闭部分的第二多种试剂；以及(d)第四容器，该第四容器含有第一洗涤组合物，该第一洗涤组合物包含聚合酶和多种核苷酸，其中该第一洗涤组合物被配置为防止第二聚合酶将该多种核苷酸之一掺入该拷贝多核苷酸链中。
13、第一洗涤组合物可包含多种核苷酸。核苷酸可包含封闭部分。核苷酸可包含可检测部分。第一洗涤组合物可被配置为防止第二聚合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
2.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一洗涤组合物包含多种核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多种核苷酸包括封闭的核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述多种核苷酸包括用可检测部分标记的核苷酸。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤组合物被配置为防止所述第二聚合酶将所述多种核苷酸之一掺入所述拷贝多核苷酸链中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中洗涤溶液基本上不含Mg2+。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸链固定在固体载体上。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸固定在流动池的表面上。
10.一种与测序设备一起使用的盒，所述盒包括：
11.根据权利要求10所述的盒，其中所述第一洗涤组合物包含多种封闭的核苷酸。
12.根据权利要求10或11所
13.根据权利要求10至12中任一项所述的盒，其中所述第一洗涤组合物基本上不含Mg2+。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的盒，所述盒还包括含有第二洗涤组合物的第五室，其中所述第二洗涤组合物基本上不含聚合酶和核苷酸。
15.一种与测序设备一起使用的试剂盒，所述试剂盒包括：
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物包含多种封闭的核苷酸。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物包含用可检测部分标记的多种核苷酸。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的试剂盒，其中所述第一洗涤组合物基本上不含Mg2+。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含有第二洗涤组合物的第五容器，其中所述第二洗涤组合物基本上不含聚合酶和核苷酸。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于使用所述试剂盒的说明书。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
2.一种多核苷酸测序方法，所述多核苷酸测序方法包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一洗涤组合物包含多种核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多种核苷酸包括封闭的核苷酸。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述多种核苷酸包括用可检测部分标记的核苷酸。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述第一洗涤组合物被配置为防止所述第二聚合酶将所述多种核苷酸之一掺入所述拷贝多核苷酸链中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中洗涤溶液基本上不含mg2+。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸链固定在固体载体上。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述模板多核苷酸固定在流动池的表面上。
10.一种与测序设备一起使用的盒，所述盒包括：
11.根据权利要求10所述的盒，其中所述第一洗涤组合物包含多种封闭的核苷酸。
12.根据权利...
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