【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种合成香草酸的方法，属于生物化工领域。
技术介绍
1、香草酸属于肉桂酸类衍生物，广泛存在于自然界中，如在香荚兰豆、香子兰的荚、秘鲁香膏、安息香膏、爪哇香毛油等许多植物及精油中均有发现。香草酸作为一种高档香料，除了具有较高的经济价值以外还具有较广泛的医学用途，具有抗菌消炎，抗氧化，抑制酪氨酸酶活性，化感作用，调节神经，促凝血活性的作用。目前香草酸的提取主要以化学合成方法为主，且存在植物原料消耗量大、产品纯度不高，分离难度大等问题，纯天然产品主要从香子兰花荚中提取，产量极少，远不能满足市场需求，因此，生物催化合成香草酸受到研究者们的广泛关注，生物催化合成香草酸最简单的途径则是香草醛通过脱氢酶作用，一步反应合成香草酸。采用酶生物催化合成香草酸具有绿色、特异性强、转化效率高等优势。
2、木质素作为地球上最为丰富且未被完全利用的能源化合之一，其本身无定型的多苯环结构使其具有极高的稳定性，这造成木质素低价值化利用的主要原因，因此目前只有少量木质素用于燃烧供能以及一些低端化工产品的加工。对木质素的解聚预处理是打破这一困境的关键，其本身的结构单元含有很多芳香族单体，解聚木质素可以获得大量的小分子单体，除此之外还可以使不同结构单元之间的化学键发生相互转化，实现一些单体的大量解聚，例如香草醛，阿魏酸等。木质素解聚生成香草酸的研究目前鲜有报道，但是围绕其前体物质香草醛的解聚已经小有成效。目前针对于木质素解聚生成香草醛多采用化学方法，主要包括热解、气化、高压水解、金属催化剂等方式，在制备过程中往往加入金属盐催化剂，大量的碱以
3、因此，亟需一种协同生物催化合成或制备香草酸的方法，解决目前技术中存在的不环保、分离纯化难度大、生产成本高等问题。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有的技术的不足，提供了一种合成香草酸的方法。本专利技术利用低共熔溶剂处理碱木质素，通过生物酶协同催化合成香草酸；其中生物催化过程中的转化底物为富含香草醛的木质素转化液；生物酶由重组大肠杆菌提取获得，重组大肠杆菌源自重组质粒的构建以及表达；最终转化产物为香草酸。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术首先提供了一种合成香草酸的方法，所述方法包括：
4、(1)低共熔溶剂的制备：
5、将氢键受体与氢键供体混合，加热搅拌，直至形成清澈的透明液体，即为所需的低共熔溶剂。
6、其中，所述氢键供体为1,4-丁二醇和cacl2.6h2o；所述氢键受体为氯化胆碱；所述氯化胆碱、1,4-丁二醇和cacl2.6h2o的摩尔比为1:3:0-0.3；所述加热温度为80-100℃；所述搅拌时间为1-2h。
7、(2)低共熔溶剂对木质素预处理：
8、将步骤(1)所得低共熔溶剂稀释后与木质素混合，充分反应后，得木质素转化液。
9、其中，所述低共熔溶剂稀释后的体积浓度为20％-60％；所述木质素为碱性木质素，所述碱性木质素的来源包括松木、杨木；所述反应条件为：反应温度30-50℃，反应时间30min；所述木质素转化液浓度为50g/l。
10、(3)重组香草醛脱氢酶工程菌株的构建：
11、对得到的香草醛脱氢酶基因以及pet-28a(+)质粒进行双酶切，连接酶切后的香草醛脱氢酶基因以及pet-28a(+)质粒，构建重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌，获得重组香草醛脱氢酶工程菌株。
12、其中，所述香草醛脱氢酶基因来源于嗜木质素芽孢杆菌l1(bacillusligniniphilus l1，于2013年保藏于日本微生物菌种保藏中心，保藏编号为jcmno.18543，16srdna序列已提交至ncbi数据库，登陆号为jq044788)，所述香草醛脱氢酶基因的核苷酸序列为genbank id：wp 017729096，具体序列信息如seq id no:1所示。
13、所述重组香草醛脱氢酶工程菌株的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。
14、(4)香草醛脱氢酶的获取及酶促反应：
15、将步骤(3)所得重组香草醛脱氢酶工程菌株进行高密度发酵后，分离得粗酶液；将所述粗酶液与步骤(2)所述木质素转化液进行酶促反应，获得香草酸。
16、其中，所述高密度发酵包括：
17、(1)细胞增值阶段，按照10％接种量，将重组香草醛脱氢酶工程菌株接种至发酵培养基中，控制细菌生长在4h内od600达到40-60；
18、(2)产酶阶段，当发酵培养基中的菌株od600达到40-60时，加入iptg诱导，通过持续补充补料培养基使od600增加到100-110。
19、进一步的，步骤(4)中所述酶促反应还包括tris-hc缓冲液及外源nad+，优选的，所述外源nad+为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
20、进一步的，步骤(4)中所述粗酶液与木质素转化液的体积比为1：0.3-1.8，所述粗酶液的酶活为0.5-3u/ml；所述木质素转化液的浓度为50g/l，所述酶促反应的条件为：100r/min搅拌，反应温度37℃，反应时间30min。
21、进一步的，所述tris-hcl缓冲液终浓度为50mmol/l，ph为7.2；所述外源nad+的终浓度为1mmol/l。
22、进一步的，将酶促反应后的上清液充分萃取，hplc测定浓度，并根据最终浓度计算香草酸含量，最终经过计算香草酸转化率达到了80.64％-82.14％。计算公式为cvr＝cvan×vn/m。cvr转化率，cvan香草酸检测浓度，vn溶液稀释倍数，m初始木质素添加质量。
23、本专利技术具有以下有益效果：
24、(1)本专利技术首次采用低共熔溶剂预处理木质素合成大量香草醛，并协同酶催化制备香草酸，使香草酸具有更高的得率，同时该方式合成香草酸具有更好的环境可持续性。
25、(2)本专利技术利用低共熔溶剂处理木质素，极大的降低了木质素预处理成本，同时，避免了有机溶剂以及金属盐离子的添加对环境的损伤。
26、(3)低共熔溶剂作为一种由天然物质合成的新型绿色溶剂，具有绿色环保、价格低廉，稳定性高等优势，符合工业化生产需求。
27、(4)低共熔溶剂和生物催化结合的方式使得香草酸的转化率达到了82.14％(碱木质素来源于松木)、80.64％(碱木质素来源于杨木)，高效的转化效率为木质素高值化利用展现了良好应用前景。
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1.一种合成香草酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述氢键供体为1,4-丁二醇和CaCl2.6H2O，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氯化胆碱、1,4-丁二醇和CaCl2.6H2O的摩尔比为1:3:0-0.3；所述加热温度为80-100℃，搅拌时间为1-2h。
3.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述低共熔溶剂稀释后的体积浓度为20％-60％；所述木质素为碱性木质素，所述碱性木质素来源包括松木、杨木；所述反应条件为：反应温度30-50℃，反应时间30min。
4.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述木质素转化液浓度为50g/L。
5.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(3)中所述香草醛脱氢酶基因来源于嗜木质素芽孢杆菌L1，所述香草醛脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示，所述重组质粒包括pET-28a(+)质粒。
6.根据权利要求1所述的一种合成香草酸
7.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(4)中所述高密度发酵包括：
8.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(4)中所述酶促反应的反应体系还包括Tris-HC缓冲液及外源NAD+。
9.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(4)中所述粗酶液与木质素转化液的体积比为1:0.3-1.8，所述粗酶液的酶活为0.5-3U/mL；所述木质素转化液的浓度为50g/L，所述酶促反应的条件为：100r/min搅拌，反应温度37℃，反应时间30min。
10.根据权利要求8所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L，pH为7.2；所述外源NAD+的终浓度为1mmol/L。
...【技术特征摘要】
1.一种合成香草酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述氢键供体为1,4-丁二醇和cacl2.6h2o，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氯化胆碱、1,4-丁二醇和cacl2.6h2o的摩尔比为1:3:0-0.3；所述加热温度为80-100℃，搅拌时间为1-2h。
3.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述低共熔溶剂稀释后的体积浓度为20％-60％；所述木质素为碱性木质素，所述碱性木质素来源包括松木、杨木；所述反应条件为：反应温度30-50℃，反应时间30min。
4.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述木质素转化液浓度为50g/l。
5.根据权利要求1所述的一种合成香草酸的方法，其特征在于，步骤(3)中所述香草醛脱氢酶基因来源于嗜木质素芽孢杆菌l1，所述香草醛脱氢酶基因的核苷酸序列如seq idno：1所示，所述重组质粒包...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱道辰，许令侠，孙建中，刘杏荣，乐易林，耿阿蕾，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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