猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。包括以下步骤：１）免疫用疫苗的制备；２）免疫；３）提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。本发明专利技术采用了特别免疫程序，猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体效价高。本发明专利技术方法制备的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体具有效果明显、特异性高、治疗效果迅速、疗效确实、生产成本低等优点，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行 性腹泻病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻是目前证实的引起猪发生腹泻的重要的两个病毒 性传染性病。这两种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这 两种病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到 底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时就可波及全群，主要是造成哺乳 期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。猪传染性胃肠炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠状 病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染 病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100%。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5 周龄以上的猪感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病以后，世界上 许多国家都相继报道了猪传染性胃肠炎。我国从1956年在广东省首次发生这种疾病后，全 国大多数省份也有猪传染性胃肠炎的发生，给养猪业带来了严重危害。猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhae, PED)是冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus,PEDV)引起的一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。各种年龄的 猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100%，尤其哺乳仔猪受害最为严重。 猪流行性腹泻主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节，但在夏季也可发生。上世纪70 年代初期许多国家相继报道了猪流行性腹泻的发生，我国上世纪80年代开始陆续有发生 猪流行性腹泻的报道。目前主要用疫苗免疫母猪来预防这两种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病 的特效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生， 其治疗效果不理想。此外，由于这两种疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱 水，很快就会衰竭而死亡。因此，在生产中急需一种针对猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒 性疾病均具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻 病毒二联蛋黄抗体及其制备方法。技术方案本专利技术中，所述“PK15”为猪肾细胞，Vero为非洲绿猴肾细胞。4所述“饱和甲醛水溶液”为市售40%甲醛水溶液。本专利技术一方面提供了一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备 方法。为实现本专利技术目的，本专利技术技术方案步骤如下1)免疫用疫苗的制备分别用猪肾传代细胞、非洲绿猴肾传代细胞培养猪传染性胃肠炎病毒及猪流行性 腹泻病毒，分别浓缩后用作抗原，将两种抗原充分混合后灭活，加入免疫增强剂及白油佐 剂，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，做为免疫用疫 苗；2)免疫用步骤1)制备的免疫用疫苗对非免疫产蛋鸡进行多次免疫，免疫次数> 2，优选 地，本专利技术的免疫次数> 4，本专利技术实施例中免疫次数为4次。3)从步骤2)免疫产蛋鸡产出鸡蛋中收集蛋黄液，提取猪传染性胃肠炎和流行性 腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。优选地，本专利技术所述的传染性胃肠炎病毒抗原的制备包括以下步骤将传染性胃 肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37°C温度下CO2培养箱 中培养，至75%细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。优选地，本专利技术所述的流行性腹泻病毒抗原的制备包括以下步骤将流行性腹泻 病毒液接种于Vero单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照，在37°C温度下CO2培养箱中培 养，至75%细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓缩后用作抗原。优选地，本专利技术所述的步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒按体积 比1 0. 8 1 1. 2混合，混合后两种病毒的毒价均彡1. OX 106_°TCID5Q/ml。优选地，本专利技术所述的步骤1)中将猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒抗原 灭活后，分别加入终浓度为体积比0. 01% 0. 05%的脂多糖和终浓度为体积比0. 2% 0. 8%的酵母葡聚糖作为免疫增强剂，与所述病毒液的总体积的2倍量的白油佐剂乳化，制 备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗作为免疫用疫苗。优选地，本专利技术所述的步骤2)中免疫程序为在首免前10日，每日用体积比 1 % 5 %的黄芪多糖供鸡饮用，提升鸡体整体免疫力，首免前7日每羽鸡皮下注射牛结核 分枝杆菌多糖核酸0. 1 0. 5ml、弗氏完全佐剂100 300 μ g，进行免疫剌激。首免时胸部肌肉多点注射免疫用疫苗1 2ml ；2周后进行二免，注射免疫用疫苗 1 2ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0. 1 0. 5ml ；再隔2周后进行三免，注射免疫用疫苗 2 4ml及牛结核分枝杆菌多糖核酸0. 2 0. 8ml ；再隔4 8周后进行四免，注射免疫用 疫苗2 4ml。优选地，本专利技术所述的步骤3)中二免后1周开始每隔7天抽样测定高免鸡蛋蛋黄 中抗猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒特异抗体效价；抗体效价均达到1 128以 上收集蛋黄，用于制备猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。优选地，本专利技术所述的步骤3)中充分搅拌使蛋黄呈均勻膏状，加入等体积经灭菌 并冷却的蒸馏水，搅拌混勻，灭活；在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为 4. 2的灭菌蒸馏水，并降温至1 4°C，然后将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4 8°C静置54h;离心分离上清液并转入另一反应罐中，按体积比为总量的0.2%加入辛酸，搅拌均勻， 室温放置2 4h ；用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按体积比为总量的0. 1% 加入饱和甲醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混勻，室温放置24h，期间振摇数次，过滤除 菌，用截留分子量为IOOOKDa的超滤膜过滤除病毒，即可得到提纯的猪传染性胃肠炎病毒 和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体。优选地，本专利技术所述的步骤3)中抗体效价检测步骤如下将收集的蛋黄液用浓度为0. 01mol/L pH为7. 2的磷酸盐缓冲液倍比稀释后加入 琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入步骤一中经离心浓缩纯化的猪传染性胃肠炎病毒(或流 行性腹泻病毒)抗原，置湿盒中37°C温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为 该蛋黄液的猪传染性胃肠炎病毒(或流行性腹泻病毒)的抗体效价。优选地，本专利技术所述的猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体为冻 干二联蛋黄抗体。优选地，本专利技术所述的步骤3)中猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋 黄抗体冻干程序是将提纯并经检验合格的蛋黄抗体液小量分装于西林瓶，于冻干机上冻 干过夜，冻干过程中温度最低降至_38°C，维持3 4h至完全冻干，然后逐渐恢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：　　１）免疫用疫苗的制备：　　分别用猪肾传代细胞、非洲绿猴肾传代细胞培养猪传染性胃肠炎病毒及猪流行性腹泻病毒，分别浓缩后用作抗原，将两种抗原充分混合后灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，做为免疫用疫苗；　　２）免疫：　　用步骤１）制备的免疫用疫苗对非免疫产蛋鸡进行免疫，免疫次数≥２；　　３）从步骤２）免疫产蛋鸡产出鸡蛋中收集蛋黄液，提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。

【技术特征摘要】
CN 2010-5-10 201010166530.5一种猪传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)免疫用疫苗的制备分别用猪肾传代细胞、非洲绿猴肾传代细胞培养猪传染性胃肠炎病毒及猪流行性腹泻病毒，分别浓缩后用作抗原，将两种抗原充分混合后灭活，加入免疫增强剂及白油佐剂，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，做为免疫用疫苗；2)免疫用步骤1)制备的免疫用疫苗对非免疫产蛋鸡进行免疫，免疫次数≥2；3)从步骤2)免疫产蛋鸡产出鸡蛋中收集蛋黄液，提取猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体，纯化后，冻干。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒抗原 的制备包括以下步骤将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立不接毒细 胞对照，在37°C温度下CO2培养箱中培养，至75%细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定 毒价，浓缩后用作抗原。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1)中流行性腹泻病毒抗原的制备 包括以下步骤将流行性腹泻病毒液接种于Vero单层细胞上，同时设立不接毒细胞对照， 在37°C温度下CO2培养箱中培养，至75%细胞出现细胞病变时收毒，中和试验测定毒价，浓 缩后用作抗原。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中猪传染性胃肠炎病毒抗原 和流行性腹泻病毒抗原按体积比1 0.8 1 1.2混合，混合后两种病毒抗原的毒价均 彡 1. 0X 106 0TCID50/ml。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中将猪传染性胃肠炎病毒 和流行性腹泻病毒混合抗原灭活后，分别加入体积比0. 01% 0. 05%的脂多糖和体积比 0. 2% 0. 8%的酵母葡聚糖作为免疫增强剂，与所述病毒液的总体积2倍量的白油佐剂 乳化，制备油包水型猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗作为免疫用疫田ο6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，乔荣岑，
申请(专利权)人：洛阳普莱柯生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]