一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法技术

一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其制备方法步骤如下：①生产用毒种的制备；②制备抗原用毒液的制备；③油乳剂灭活苗的制备；④高免蛋制备；⑤分离蛋黄；⑥灭活Ⅰ及提取；⑦灭活Ⅱ及粗滤、深滤；⑧灭活Ⅲ及除菌过滤；⑨配制、包装。将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用０．０１５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２的灭菌ＰＢＳ稀释抗体至中和抗体效价为１∶２５６～１∶１０２４，加入终浓度为０．０２％（体积百分比）吐温－８０作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。该产品具有纯度高、特异性强、易保存、无残留等优点，对鸭病毒性肝炎的预防与治疗具有极好的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及禽类生物药制剂
，具体地讲涉及一种鸭病毒性肝炎精 制蛋黄抗体的制备方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(DVH)是雏鸭的一种急性致死性传染病。该病发病急、传 播快、发病率和致死率可高达100%。我国自1958年在上海首次分离到鸭肝炎 病毒(DHV)以来，相继在全国许多省市流行发生，造成巨大的经济损失，已 成为影响养鸭业健康发展的重要威胁。鸭病毒性肝炎主要威胁20日龄以内的雏鸭，此时雏鸭的免疫系统发育尚不 完善，疫苗免疫后难以达到预防效果，较高的母源抗体虽然可以使雏鸭在2周 内免受病毒的袭击，但在一些母源抗体水平较低、卫生状况较差和其他的一些 应激因素作用下，该病仍时有发生。目前，在缺乏有效的治疗药物的情况下， 利用鸭病毒性肝炎抗体来进行治疗和预防该病的发生，仍然是十分有效的。目前我国主要利用蛋黄液抗体预防该病的发生，其生产的蛋黄液抗体存在 诸多缺点1、蛋黄内含有一些可以垂直传播给雏鸡的病原，如霉形体、沙门氏 菌、腺病毒及呼肠孤病毒等，如在蛋黄抗体生产中未进行严格消毒和灭活，即 可导致人为传毒。2、蛋壳表面污染的常在菌，用粗制方法无法灭活；3、高浓 度蛋黄液为污染菌的繁殖提供了最有利的条件；4、贮存不便，贮存成本较高； 5、使用极不方便，因其粘度大，易堵塞注射器；6、应激反应较为强烈。因此， 禁止这种粗制蛋黄抗体的生产和使用，取而代之的是另一种更为安全和有效的 抗体制剂，既是生产的需要，也是众多从事生物制品的专家学者的追求目标。
技术实现思路
为了克服现有技术不足，本专利技术公开了，该产品能更好的预防和治疗鸭病毒性肝炎，减少广大养殖户的经济 损失。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案所述，其制备方法步骤如下① 、生产用毒种的制备将AV2111-5株毒种用灭菌生理盐水作1(^稀释， 将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9~10日龄SPF鸡胚，置37'C孵 育，收获48 96小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；② 、制备抗原用毒液的制备将生产用毒种用灭菌生理盐水作10—2稀释， 绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种O.lml，接种后于37t孵化96小时。 收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤。③ 、油乳剂灭活苗的制备取抗原用毒液加入0.2%的福尔马林溶液37'C24h 灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121°C 103kPa灭 菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水 相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成。 、高免蛋制备取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡， 免疫4次，每次间隔7 10日，每次免疫1.0ml，第四次免疫后7日开始收集鸡蛋；⑤ 、分离蛋黄将收获高免鸡蛋进行蛋黄分离备用；⑥ 灭活I及提取将分离的蛋黄用0.015mol/LpH7.2的灭菌PBSl: 1稀释， 6(TC加热灭活15分钟；加入终浓度为14~19%的硫酸铵，8000转/分离心15分 钟，收集沉淀。⑦ 、灭活II及粗滤、深滤将收集的沉淀用0.015mol/LpH7.2的灭菌PBS 作l: 4稀释后，加入0.2%的辛酸室温放置2小时；之后用板框滤器进行粗滤与 深滤；⑧、灭活m及除菌过滤将深滤后的滤液加入终浓度为0.1%甲醛溶液， 充分搅拌混匀，密封60分钟；用0.22拜微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；◎、配制、包装将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用 0.015mol/LpH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1:256 1:1024，加入终 浓度为0.02% (体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分 装。本专利技术采用免疫原性良好的鸭肝炎病毒AV2111-5株毒种，此株病毒为由购 自农业部中国兽医药品监察所的鸭病毒性肝炎种毒AV2111株在10日龄SPF鸡 胚传5代后而来。接种后的鸡胚基本稳定在48 96小时胚胎死亡，死亡率可达 90%以上。由于采用了如上所述技术方案，本专利技术具有如下优越性本专利技术采用了一种集热灭活、化学灭活及物理灭活为一体的综合灭活技术。即对蛋黄中添加的指示微生物能完全彻底灭活，而且不影响抗体效价。无化学残留、无毒副作用。由于采用了硫酸铵沉淀法，并且在14~19%的浓度时沉淀效果最佳，抗体效价也最高。采用本专利技术生产的产品具有纯度高、特异性强、易保存、无残留等优点。 该产品对鸭病毒性肝炎的紧急预防与治疗具有极好的效果。 具体实施例方式实施例1:其制备方法步骤是 ①、生产用毒种的制备将购自农业部中国兽医药品监察所的鸭病毒性肝 炎种毒AV2111株在10日龄SPF鸡胚传5代后而来的AV2111-5株毒种用灭菌生 理盐水作10-2稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9~10日龄SP鸡胚，置37'C孵育，收获48 邻小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；② 、制备抗原用毒液的制备将生产用毒种用灭菌生理盐水作10'2稀释，绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种O.lml,接种后于37t:孵化96小时。 收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤。③ 、油乳剂灭活苗的制备取抗原用毒液加入0.2%的福尔马林溶液37°C24h 灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121°C 103kPa灭 菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水 相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成。④ 、高免蛋制备取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡， 免疫4次，每次间隔7 10日，每次免疫1.0ml，第四次免疫后7日开始收集鸡蛋；⑤ 、分离蛋黄将收获高免鸡蛋进行蛋黄分离备用；⑥ 灭活I及提取将分离的蛋黄用0.015mol/LpH7.2的灭菌PBSl: 1稀释， 6(TC加热灭活15分钟；加入终浓度为14%的硫酸铵，8000转/分离心15分钟， 收集沉淀。⑦ 、灭活II及粗滤、深滤将收集的沉淀用0.015mol/LpH7.2的灭菌PBS 作l: 4稀释后，加入0.2%的辛酸室温放置2小时；之后用板框滤器进行粗滤与 深滤；⑧ 、灭活III及除菌过滤将深滤后的滤液加入终浓度为0.1%甲醛溶液， 充分搅拌混匀，密封60分钟；用0.22^微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；◎、配制、包装将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用 0.015mol/LpH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1:256，加入终浓度为 0.02% (体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。实施例2:其制备方法步骤是其制备步骤①、②、③、④、⑤、⑦、⑧同实施例1制备步骤①、②、③、 、 ⑤、⑦、⑧；步骤⑥、⑨变为⑥灭活I及提取将分离的蛋黄用0.015mol/LpH7.2的灭菌PBSl: 1稀释， 6(TC加热灭活15分钟；加入终浓度为16°/。的硫酸铵，8000转/分离心15分钟， 收集沉淀。⑨、配制、包装将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用 0.015mol/LpH7.2的灭菌PBS稀释抗体至中和抗体效价为1:512，加入终浓度为 0.02% (体积百分比)吐温-80作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。实施例3:其制备方法步骤是其制备步骤①、②、③、④本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其特征是：其制备方法步骤如下：　①、生产用毒种的制备：将ＡＶ２１１１－５株毒种用灭菌生理盐水作１０↑［－２］稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的９～１０日龄ＳＰＦ鸡胚，置３７℃孵育，收 获４８～９６小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；　②、制备抗原用毒液的制备：将生产用毒种用灭菌生理盐水作１０↑［－２］稀释，绒毛尿囊腔接种１０日龄的鸡胚，每枚胚接种０．１ｍｌ，接种后于３７℃孵化９６小时；收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜， 研磨、过滤；　③、油乳剂灭活苗的制备：取抗原用毒液加入０．２％的福尔马林溶液３７℃２４ｈ灭活，取白油９６份，司本４份，硬脂酸铝２份，混合均匀后１２１℃　１０３ｋＰａ灭菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液９８份，吐温２份，混合均匀后制 成水相。取油相２份，水相１份，混合乳化制成；　④、高免蛋制备：取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡，免疫４次，每次间隔７～１０日，每次免疫１．０ｍｌ，第四次免疫后７日开始收集鸡蛋；　⑤、分离蛋黄：将收获高免鸡蛋进行蛋 黄分离备用；　⑥灭活Ⅰ及提取：将分离的蛋黄用０．０１５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２的灭菌ＰＢＳ１∶１稀释，６０℃加热灭活１５分钟；加入终浓度为１４～１９％的硫酸铵，８０００转／分离心１５分钟，收集沉淀；　⑦、灭活Ⅱ及粗滤、深滤：将收 集的沉淀用０．０１５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２的灭菌ＰＢＳ作１∶４稀释后，加入０．２％的辛酸室温放置２小时；之后用板框滤器进行粗滤与深滤；　⑧、灭活Ⅲ及除菌过滤：将深滤后的滤液加入终浓度为０．１％甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封６０分钟；用 ０．２２μｍ微孔滤芯过滤除菌，收集滤液备用；　⑨、配制、包装：将收集的无菌过滤液进行鸭肝中和抗体效价测定，用０．０１５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２的灭菌ＰＢＳ稀释抗体至中和抗体效价为１∶２５６～１∶１０２４，加入终浓度为０．０２％（体积百 分比）吐温－８０作稳定剂并充分混匀，分装，无菌定量分装。...

【技术特征摘要】
1、一种鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法，其特征是其制备方法步骤如下①、生产用毒种的制备将AV2111-5株毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，将稀释后的毒种经绒毛尿囊腔接种发育良好的9～10日龄SPF鸡胚，置37℃孵育，收获48～96小时死亡且胚体病变典型的鸡胚的尿囊液；②、制备抗原用毒液的制备将生产用毒种用灭菌生理盐水作10-2稀释，绒毛尿囊腔接种10日龄的鸡胚，每枚胚接种0.1ml，接种后于37℃孵化96小时；收获胚液、胚体及绒毛尿囊膜，研磨、过滤；③、油乳剂灭活苗的制备取抗原用毒液加入0.2％的福尔马林溶液37℃24h灭活，取白油96份，司本4份，硬脂酸铝2份，混合均匀后121℃103kPa灭菌后制成油相，取灭活后的抗原用病毒液98份，吐温2份，混合均匀后制成水相。取油相2份，水相1份，混合乳化制成；④、高免蛋制备取步骤③中制备的油乳剂灭活油苗免疫刚开产的产蛋鸡，免疫4次，每次间隔7～10日，每次...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙进忠，乔荣岑，习向锋，闵亚杰，晋春霞，
申请(专利权)人：洛阳普莱柯生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]