一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法包括线形打靶ＤＮＡ的设计和制备、含Ｒｅｄ系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和减毒活疫苗的制备。本发明专利技术所述抗弧菌病的减毒活疫苗是对拟态弧菌外毒素基因进行剔除后得到的，可以产生较好的免疫保护性，其免疫保护率可达８４％。本发明专利技术抗弧菌病的减毒活疫苗可用于免疫多种海水养殖鱼类，可提高鱼类产量，适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疫苗制备领域，具体涉及一种抗弧菌病的减毒活疫苗及其制备方法和 应用。
技术介绍
弧菌病是海水养殖动物中常见的流行病，在现有的技术中，目前只有鳗弧菌菌体 疫苗的生产和应用，尚未见弧菌减毒活疫苗的生产和应用。鳗弧菌菌体疫苗在水产养殖生 产中具有较专一的抗弧菌特异性，对抗鳗弧菌引起的疾病具有较高的抗性，但正是由于其 作用专一，对其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用较差，在生产应用中存在非常明显的 局限性。此外，传统的细菌疫苗的生产工序上在最后环节加入灭活用药物，残留于疫苗中， 导致存在副作用。因此，迫切需要一种可以对多种弧菌病均有抗性的、无副作用的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有的抗弧菌病疫苗中存在的作用专一、对除鳗弧菌之外 的弧菌引起的疾病的防御性较差、灭活用药用残留于疫苗中存在副作用的问题，提供一种 对多种弧菌病均有抗性的、无副作用的抗弧菌病的减毒活疫苗。本专利技术另一目的在于提供上述抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述抗弧菌病的减毒活疫苗的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现本专利技术抗弧菌病的减毒活疫苗产生菌种为拟态弧菌(Vibrio mimicus)，其特性能 完全为作用动物所接受。本专利技术所述的抗海水养殖动物弧菌病的减毒活疫苗的制备通过以下步骤实现 的1，线形打靶DNA的设计和制备。2，含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建。3，电击感受态拟态弧菌的制备。4，电击转化。5，基因敲除突变株的筛选。6，突变株中抗性基因的剔除。7，减毒活疫苗的制备。本专利技术提供的减毒活疫苗的生产工艺，具体制备方案是这样实现的(1)线形打靶DNA的设计和制备设计一对引物，引物序列如SEQ ID N0:1 2所示，其中一条引物5，末端的 40-50bp与外毒素基因5’端同源，3’与卡那霉素(Km)抗性基因同源；另一条引物5’末端 的40-50bp与外毒素基因3’端同源，3’与卡那霉素(Km)抗性基因的另一端同源。以含卡 那霉素(Km)抗性基因的质粒为模板，通过PCR扩增出中间为卡那霉素(Km)抗性基因、两端3为40-50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。(2)含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建将含有Red系统3个基因的质粒转化到宿主菌拟态弧菌中，通过调节温度和加入 诱导剂来控制Red系统的表达。本专利拟采用辅助质粒PKD20，该质粒含有整套Red系统， 有优化的核糖体结合位点，在阿拉伯糖启动子ParaB控制下高效表达λ蛋白、β蛋白和 Exo核酸外切酶。此外，该质粒还是一个温度敏感性复制子，37°C生长时就能轻易从宿主中 消除。(3)电击感受态拟态弧菌的制备将含Red系统的宿主菌拟态弧菌培养过夜，再将隔夜培养的菌株转接到含卡那霉 素的培养基中继续培养，在终止前不同时间加入不同量的L-阿拉伯糖来诱导Red系统的表 达。离心收集菌体，制成所需的电击感受态菌体。(4)电击转化利用电击转化的方法将线形打靶DNA转入感受态拟态弧菌，获得外毒素基因缺失 并对卡那霉素具有抗性的突变株。电击转化的电压设置为不同的数值，以期找到最佳的电 击电压值。(5)基因敲除突变株的筛选由于所用的线形打靶DNA中间含卡那霉素(Km)抗性基因，与外毒素基因片段置换 后即可整合到宿主菌拟态弧菌的染色体上表达卡那霉素抗性，根据这个特点，利用选择培 养基筛选外毒素基因敲除的阳性突变株。(6)突变株中抗性基因的剔除本专利技术拟选择一个能表达FLP重组酶的帮助质粒PCP20去除卡那霉素(Km)抗 性基因，FLP重组酶作用于卡那霉素(Km)抗性基因两端的FRT位点，通过重组将卡那霉素 (Km)抗性基因剔除。帮助质粒PCP20和辅助质粒pKD20—样，都属于温度敏感性复制子， 37°C生长时就能轻易从宿主中消除。(7)减毒活疫苗的制备FLP/FRT系统对抗性基因的剔除有可能只发生在部分突变株中，因此，需要进一步 筛选抗性基因已剔除的突变株。本专利技术拟采用平板影印接种法(r印licaplating)进行不 含抗性基因的突变株筛选。筛选出的不含抗性基因的突变株即为减毒活疫苗。本专利技术减毒活疫苗可以用于免疫海水养殖鱼类或提高养殖产量。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术所提供的抗海水养殖动物减毒活疫苗的用途，是可应用于海水养殖动物弧 菌病的免疫，这种疫苗能产生较好的免疫保护性，其免疫保护率平均可达84%。该疫苗适用 于免疫多种海水养殖鱼类，并具有提高养殖产量的效果。利用上述制备的疫苗经浸泡免疫 养殖动物，其保护效果见表1 2 表1疫苗在网箱养殖真鲷中的试用效果4 表2疫苗在网箱养殖石斑鱼中的试用效果 附图说明图1为线形打靶DNA的制备，其中， 氯霉素抗性基因；_与外毒素基因同源的短序 列Tl和T2 ；口 FRT位点。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例11.取经活化的拟态弧菌10ml，接种于IOOOml经过滤的普通海水营养培养基，30°C、200rpm摇床培养18-20小时。2.实验引物设计一对引物，其中引物Tl-Al的5、末端的21bp与外毒素基因5’ 端同源，3、与氯霉素抗性基因同源；另一条引物T2-A25—末端的21bp与外毒素基因3、端 同源，3、与氯霉素抗性基因的另一端同源。3.线形打靶DNA的制备以含氯霉素抗性基因的质粒pKD3为模板，通过PCR扩增 出中间为氯霉素抗性基因、两端为50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。4.电击感受态拟态弧菌的制备将质粒PKD46转化到宿主菌拟态弧菌中，在含有 氨苄青霉素和氯霉素的平板上30°C培养过夜，转接至液体TCBS培养基中30°C继续培养至 0D600为0. 20-0. 25，并在培养终止前Ih加入10%的L-阿拉伯糖，使终浓度约为6mmol/L。 离心收集菌体，用灭菌去离子水洗涤2次，再用10%灭菌甘油洗1次，最后用10%灭菌甘油 悬浮，使感受态细胞的最终浓度为lOlOcells/μ 1，制成含有质粒pKD46的电击感受态拟态 弧菌。5.电击转化用上述扩增产生的一次PCR产物0. 5-3 μ g与50 μ 1含pKD46的电 击感受态拟态弧菌细胞混合，将混合物加入0. Icm的Bio-Rad电击杯中进行电击转化。电 击转化参数为电阻200 Ω，电容25 μ F，电压设置为不同的数值，以期找到最佳的电击电压 值(电击电压值2. 5kv,电击时间5ms)。电击细胞用Iml SOC培养基悬浮，37°C，225r/min， 复苏1.5h，然后涂布于含氯霉素(12. 5g/ml)TCBS平板上，37°C培养。6.基因敲除突变株的筛选由于所用的线形打靶DNA中间含氯霉素抗性基因，与 外毒素基因片段置换后即可整合到宿主菌拟态弧菌的染色体上表达氯霉素抗性，根据这个 特点，利用选择培养基筛选外毒素基因敲除的阳性突变株。7.突变株中抗性基因的剔除将氯霉素抗性筛选出的宿主菌拟态弧菌制成化学 感受态，导入质粒PCP20，于含氨苄青霉素和氯霉素的平板上30°C培养筛选阳性转化子，然 后转接至无抗性培养基中，30°C培养8h，热诱导FLP重组酶表达，后提高到42°C过夜，质粒 也逐渐丢火。用接种环蘸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括线形打靶ＤＮＡ的设计和制备、含Ｒｅｄ系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和制备减毒活疫苗；其中，所述线形打靶ＤＮＡ的设计和制备是：设计一对引物，引物序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１～２所示，一条引物５’末端的４０～５０ｂｐ与外毒素基因５’端同源３’端与卡那霉素抗性基因的一端同源；另一条引物５’末端的４０～５０ｂｐ与外毒素基因３’端同源，３’端与卡那霉素抗性基因的另一端同源；以含卡那霉素抗性基因的质粒为模板，通过ＰＣＲ扩增出中间未卡那霉素抗性基因、两端为４０～５０ｂｐ外毒素基因同源臂且含有ＦＲＴ位点的线形打靶ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
一种抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述方法包括线形打靶DNA的设计和制备、含Red系统的宿主菌拟态弧菌的构建、电击感受态拟态弧菌的制备、电击转化、基因敲除突变株的筛选、突变株中抗性基因的剔除和制备减毒活疫苗；其中，所述线形打靶DNA的设计和制备是设计一对引物，引物序列如SEQ ID NO1～2所示，一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因5’端同源3’端与卡那霉素抗性基因的一端同源；另一条引物5’末端的40～50bp与外毒素基因3’端同源，3’端与卡那霉素抗性基因的另一端同源；以含卡那霉素抗性基因的质粒为模板，通过PCR扩增出中间未卡那霉素抗性基因、两端为40～50bp外毒素基因同源臂且含有FRT位点的线形打靶DNA。2.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述含Red 系统的宿主菌拟态弧菌的构建是将含有Red系统3个基因的质粒转化到宿主菌拟态弧菌 中，通过调节温度和加入诱导剂来控制Red系统的表达。3.根据权利要求2所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述质粒为 pKD20。4.根据权利要求1所述的抗弧菌病的减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述电击感 受态拟态弧菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴后波，苏晓波，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]