一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步骤：采集腋芽，进行消毒及萌芽；生根诱导和白化苗诱导培养；以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有多胺；以及，将产生的愈伤组织分化出不定芽。本发明专利技术利用白化苗的茎段经愈伤组织再生途径分化出芽，愈伤组织再生途径可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，是转基因的基础。而且，以林场中生长的无性系成年桉树的萌芽条为基础，再生系统的再生效率达３０％以上，可以应用于ＤＨ３２－２９、广林九号及其它优良无性系，为利用现代生物技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，具有十分重要的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及桉树的组织培养
域，尤其是指一种诱导桉树产生愈伤组织并 分化出芽的方法。
技术介绍
桉树是桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus植物的统称。多数桉树为常绿高大 乔木，而少数为小乔木或灌木。桉树分布于热带与亚热带地区，属于喜光植物，而且根系粗 壮发达。桉树具有速生，丰产，适应性强，生产周期短，用途广等特点，是可作为纸浆材料的 主要的速生栽培树种之一。桉树目前已被多个国家和地区广泛种植，桉树人工林面积约占 世界人工林总面积的三分之一。桉树除作为纸浆材和纤维板材的用途之外，还可以作为提 取单宁和精油的原料，因此具有广泛的开发利用价值。经过多年组织培养和扦插等无性系育苗的研究，以及杂交育种和选优等传统选种 育种工作，目前生产上广泛使用的就是巨桉和尾叶桉的杂交品种，例如DH32-29，广林九号 及其它优良无性系。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，常规 的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。因此人们希望利用新兴的基因工程技术 来解决桉树常规育种难以解决的问题，定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育种是 以现代分子生物学技术为基础，将目的基因通过体外重组导入受体细胞，然后再生出完整 植株以培育出新桉树品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术 的不足，加速优质，高价值桉树新品种的选育。目前利用植物转基因技术存在几个问题一是转化效率偏低；二是主要转化技术 限于赤桉、巨桉等品种，在其他桉树品种中报道很少；三是大部分成功再生的实验材料是以 种子为基础，种子变异大，难以应用于无性系的桉树杂交种。由于广泛栽培的DH32-29、广林 九号等优良无性系通过叶盘和茎段愈伤组织的再生效率极低，难以获得较多数量的独立转 化植株从而筛选出外源基因表达良好的株系，转基因育种的发展收到极大地限制。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出的方 法，解决现有桉树愈伤分化出芽的转化率低，不能对杂交种进行愈伤分化出芽，从而限制基 因育种等问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案一种诱导桉树产生愈伤组织并 分化出芽的方法，包括以下步骤1)采集腋芽，进行消毒及萌芽；2)生根诱导和白化苗诱导培养；3)以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有 多胺；4)将产生的愈伤组织分化出不定芽。所述第1步骤是采集2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段，经消毒处理后接种在 MS培养基上萌发得到无菌芽；萌芽的培养条件是温度22-30°C，无光照；所述消毒的方法 是采用酒精和升汞消毒，并用无菌水冲洗。第2步骤具体包括以下步骤a)将第(1)步骤获得腋芽萌发芽转移到含0.l-2mg/L细胞分裂素，0. 01-lmg/L生长素 的MS培养基上诱导产生丛生芽；b)丛生芽中的健壮芽丛转移到含0.1-lmg/L生长素的1/2MS培养基上诱导产生生根苗；c)将生根苗切掉顶芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO31650_6000mg/L、KH2PO4 170-800mg/L的MS培养基上，在黑暗中进行白化苗诱导培养。优选地，第2步骤具体包括a)切取一定长度的腋芽，转移到含0.l-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 01-lmg/L萘乙酸的MS 培养基上，培养21-28天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；b)切取生长至一定长度的芽，转移到含0.1-lmg/L 3-吲哚丁酸的1/2MS培养基上进行 生根诱导15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001x，温度22-30°C ；c)将生根苗切掉顶芽，保留根和基部的若干个腋芽，接种在含蔗糖30-100g/L、NH4NO3 4500mg/L、KH2PO4 500mg/L的MS培养基上进行白化苗诱导培养，暗培养14-35天，温度 22-30 "C。第3步骤中，愈伤诱导培养基优选是含50-200mg/L腐胺、5_30mg/L亚精胺的MS培养基。第3步骤中，愈伤诱导培养基进一步包含0. 2-2mg/L细胞分裂素、0. 01-0. lmg/L 生长素。优选地，第3步骤具体包括a)以白化苗的茎段切段为外植体，接种在含0.05-0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸， 0. 1-0. 5mg/L 6-苄基嘌呤的MS培养基上进行细胞活化培养，暗培养0_6天，温度22-30°C;b)活化后的外植体转移到含0.2-2mg/L N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，0. 01-0. Img/ L萘乙酸，50-200mg/L腐胺，5_30mg/L亚精胺的MS培养基上培养产生愈伤组织，暗培养5-7 天，温度22-30 0C ；c)转移到弱光照培养12-14天，光照12-18小时/天，光照强度20-2001X，22-30°C。所述第4步骤是将第(3)步骤产生的愈伤组织转移到分化培养基上培养，使愈伤 组织分化不定芽，所述的分化培养基是含有多胺的MS培养基。其中，第4步骤的分化培养基进一步包含0.2-2mg/L细胞分裂素，0. 05_0. 5mg/L 生长素。优选地，所述第4步骤具体包括a)将获得的愈伤组织，转移到含0.2-2mg/L 6-苄基嘌呤，0. 05-0. 5mg/L萘乙酸， 10-40mg/L腐胺，0. 5-3mg/L亚精胺的MS培养基上，每隔14-25天转移到相同的分化培养基 上继代培养，光照12-18小时/天，光照强度500-30001χ，温度22_30°C ；b)在分化培养基上继代培养14-100天产生不定芽。本专利技术的有益效果如下本专利技术利用白化苗的茎段，经愈伤组织再生途径分化出 芽，愈伤组织再生途径可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，是转基因的基础。而 且，本专利技术建立的诱导桉树杂交种产生愈伤组织并分化出芽的方法，以林场中生长的无性 系成年桉树的萌芽条为基础，再生系统的再生效率达30%以上，可以应用于DH32-29、广林 九号及其它优良无性系，为利用现代生物技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，具有 十分重要的经济价值。具体实施例方式本专利技术公开了一种诱导桉树杂交种产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步 骤(1)采集腋芽，进行消毒及萌芽；(2)生根诱导和白化苗诱导培养；(3)愈伤组织的诱导；(4)分化出不定芽。第(1)步骤中，采集2-4年生杂交桉树新生的萌芽条，优选采集腋芽开始膨大，芽 鳞片尚未开裂的萌芽条，切成1. 5-2. Ocm长的带腋芽的茎段，经消毒处理后接种在MS培养 基上萌发，得到无菌芽。茎段的消毒方法是(a)75%乙醇浸泡20秒；(b)无菌水冲洗2次；(c)0.1%升汞浸泡5分钟；(d)倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；(e)修剪成0.5-1. Ocm长的带腋芽的茎段；(f)0.1%升汞浸泡2分钟；(g)倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；(h)接好的材料暗培养21-28天。萌芽用的培养基是，MS基本培养基含30g/L蔗糖，7g/L琼脂，以及pH5. 8。萌芽的培养条件是，温度22_30°C，无光照。第(2)步骤中，进一步包括以下培养步骤(a)切取1.0cm长的腋芽，转移到含0.l_2mg/L细胞分裂素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导桉树产生愈伤组织并分化出芽的方法，包括以下步骤：１）采集腋芽，进行消毒及萌芽；２）生根诱导和白化苗诱导培养；３）以白化苗的茎段切段为外植体进行诱导培养获得愈伤组织，该愈伤诱导培养基含有多胺；４）将产生的愈伤组织分化出不定芽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，张兰英，孟丽娜，王利芳，江淑珍，陈方，李凝，
申请(专利权)人：普罗米绿色能源深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94