高纯度ＤＤＭＰ大豆皂苷单体分离制备的方法技术

大豆皂苷是大豆中含有的一类重要的生物活性成分，本研究的目的就在于利用高速逆流色谱（ＨＳＣＣＣ）对高纯度ＤＤＭＰ大豆皂苷进行制备分离和单体纯化。首先是利用大豆胚芽粉脱脂后经溶剂萃取和固相萃取制备大豆皂苷和异黄酮粗提物。大豆皂苷和异黄酮粗提物进一步分离制备实验分为粗分和细分两步，粗分的目的在于从大豆皂苷和异黄酮粗提物中分离出大豆皂苷单体混合物，而细分的目的则是从粗分得到的大豆皂苷混合物中分离出高纯度的ＤＤＭＰ大豆皂苷单体。粗分实验中，５％乙酸浓度下的正丁醇－水（１∶１）体系对大豆皂苷与大豆异黄酮等物质的分离效果最佳。对于柱体积３００ｍＬ的ＨＳＣＣＣ仪器，１００ｍｇ是最合适的进样量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的制备方法，尤其是一种高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法。
技术介绍
大豆皂苷(Soyasaponin)是大豆中含有的一类重要的生物活性成分，具有显著的降血脂、抗动脉粥样硬化、抗病毒等多种重要的生理功能，在医药、食品等领域具有很大的应用潜力。大豆皂苷一般可分为A组大豆皂苷、B组大豆皂苷、E组大豆皂苷和DDMP组大豆皂苷。每一组又可分为多种单体，具体有：A组皂苷结构式如下：B、E、DDMP类皂苷的结构式如下：表1.A组、B组、E组和DDMP组大豆皂苷基团结构及其相对应的分子量-->大豆皂苷在大豆中含量少，且极性大，亲水性强，与杂质分离较困难；另外，大豆皂苷同与之共存的大豆异黄酮极性部分重叠也给大豆皂苷的分离纯化造成一定的困难；此外，大豆皂苷还具有起泡性，这也给大豆皂苷的制备增加了困难；同时，大豆皂苷类别多，有些皂苷结构差别不大，尤其是分离过程中导致一些天然结构的变化，如DDMP大豆皂苷在受热和pH变化偏离中性的条件下都很容易发生降解，这些都导致纯化单体获得标准品的难度增加。目前还没有非常有效的分离纯化方法，尤其是对DDMP大豆皂苷。经对现有技术文献的检索发现，目前为止，已有一些技术都是工业化生产富含大豆皂苷混合物的方法。如中国专利CN101278729A、CN1923845A、CN1245811A、CN1315323、CN1327983A、CN1590385A、CN1683362A、日本专利JP2003-171393A等。也有专利公开文献记载：分离或制备高纯度大豆皂苷的技术或方法，如根据检索发现中国专利申请号：200810200834.1，名称：一种高纯度大豆皂苷A和B的制备方法，该技术称：涉及一种高速逆流色谱(HSCCC)制备高纯度大豆皂苷A和B的方法，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B。该技术制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B能够达到相当高的纯度，并且该制备方法操作简便、分离效率高、分离量较大、回收率高以及重现性好。但是，该专利技术分离的到的是高纯度的大豆A组皂苷和大豆B组皂苷，即实现的是大豆皂苷的组分离，尚不能有效得到高纯度的各单体皂苷的分离，尤其是DDMP大豆皂苷。DDMP大豆皂苷是各类皂苷中最具有生物活性，也是最不稳定的一种。DDMP大豆皂-->苷只有在非常温和的提取条件下才不会被破坏，因此解决DDMP皂苷的分离纯化已经成为现有技术的一个难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提出一种高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，使其满足分离量大、纯度高和避免产品降解的综合要求。本专利技术包括步骤如下：①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；②大豆皂苷粗分离；③大豆皂苷细分离。步骤①中所述的大豆皂苷粗提物，其制备方法为：A、脱脂：用石油醚(30-60℃)在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出后在通风处自然挥干石油醚。B、溶剂提取：将脱脂的大豆胚芽粉按采用8-10∶1的液料比(mL/g)溶于约的70％的乙醇水溶液，置于摇床上，在25℃水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz的超声波预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇。C、固相萃取：将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温下，流速控制在0.5-2.0BV/h；1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0.5-2.0BV/h洗脱杂质；3-5BV的≥95％的低级醇于室温下2.0-5.0BV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。步骤②中所述的大豆皂苷粗分离，其制备方法为：选择上相为固定相，下相为流动相的溶剂体系，加入体积百分比3.0-5.0％的乙酸，以助于洗脱，体系中各组分按选定正丁醇-水体积比＝1∶1，或乙酸乙酯∶丁醇∶甲醇∶水体积比＝3-4∶0.5-1.0∶1∶5.0-6.0，作为大豆皂苷的粗分溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层，待平衡20-40分钟后，将上相和下相分开，即得粗分溶剂体系；先用固定相充满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动相以20-30ml/min的流速泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，大豆皂苷和异黄酮粗提物100-300mg用5-10mL的上相：下相体积比1∶1溶解后由进样阀进样；分别根据检测器图谱接收目标成分，将馏分进行浓缩冻干后，得到大豆皂苷混合物。步骤③中所述的大豆皂苷细分离，其制备方法为：选择氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水体积比＝4∶3∶0.1∶2体系或乙酸乙酯∶正丁醇∶水体积比＝1∶6∶7体系，氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水体积比＝4∶3∶0.1∶2体系下试验了两种流动相流速：3mL/min和1.5mL/min。乙酸乙酯∶正丁醇∶水体积比＝1∶6∶7体系的体系流速为1.5mL/min。将溶剂体系的上相(固定相)连续泵入HSCCC螺旋管，待螺旋管完全充满固定相后，开启HSCCC主机，缓慢调整螺旋管转速至900r/min，设置恒温水浴为25℃。顺时针旋转，同时以设定流速泵入流动相。当螺旋管尾端流出流动相，系统达到动力学平衡时，计量固定相保留率。然后将检测体系准备好，将30-50mg大豆皂苷混合物溶于5mL下相后，通过进样阀注入螺旋管中。根据色谱图手动收集各馏分。将收集到的馏分旋转蒸发至5-10mL体积。-->本专利技术的优点及应用范围：大豆皂苷的提取一般通过一个初步的萃取过程得到大豆皂苷粗提物，然后再通过逆流色谱等分离技术分离得到大豆皂苷。鉴于大豆皂苷粗提物中含有多类物质，如各种大豆异黄酮和各种大豆皂苷。而且大豆皂苷总共有20种，一些大豆皂苷之间差异很小。为能最大程度的提取到大豆皂苷，采取分步提取的策略，先将大豆皂苷与其他类物质(大豆异黄酮)分开(粗分)，然后再进行细分至大豆皂苷单体，即分为粗分和细分两个过程。粗分过程主要目的是将各种大豆皂苷与大豆异黄酮类物质分离开，得到各类大豆皂苷的混合物，为细分分离大豆皂苷单体做准备。本专利技术是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，综合看来，高速逆流色谱具有原理简单、操作简便、能够有效保持物质活性等优点，运用高速逆流色谱法制备大豆皂苷将具有很大的潜力。本专利技术实验分离得到了四种大豆皂苷，分别是大豆皂苷Aa、Ab和两种DDMP皂苷αg及βg。本专利技术虽然通过了粗分和细分两个步骤，仍然分离到了DDMP类皂苷，是大豆皂苷分离的一个突破。本专利技术为DDMP大豆总体皂苷单体皂苷的定量分析提供了基础，对于大豆皂苷的分析检测标准的建立也具有重要的意义。附图说明图1含5％乙酸的正丁醇-水溶剂体系HSCCC图(粗分)；图2含5％乙酸的正丁醇溶剂体系各馏分的HPLC色谱图；图3氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.1∶2，v/v/v/v)体系在流速3.0mL/min下HSCCC色谱(细分)图；图4氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水(4∶3∶0.1∶2，v/v/v/v)体系(3.0mL/min)下各馏分“1”和“2”的HPLC色谱图；图5乙酸乙酯∶正丁醇∶水(1∶6∶7，v/v/v)体系HSCCC色谱图(细分)；图6乙酸乙酯∶正丁醇∶水(1∶6∶7，v/v/v)体系下馏分“3”的HPLC色谱图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的实施例作详细说明：本实施例在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度ＤＤＭＰ大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征在于，包括步骤如下：　　①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；　　②大豆皂苷粗分离；　　③大豆皂苷细分离。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征在于，包括步骤如下：①利用大豆胚芽粉制备大豆皂苷粗提物；②大豆皂苷粗分离；③大豆皂苷细分离。2.根据权利要求1所述的高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征是，步骤①中所述的大豆皂苷粗提物，其制备方法为：A、脱脂：用30-60℃石油醚在索氏抽提装置中进行脱脂抽提大约3h左右，取出后在通风处自然挥干石油醚；B、溶剂提取：将脱脂的大豆胚芽粉按采用8-10∶1的液料比mL/g，溶于约的70％的乙醇水溶液，置于摇床上，在25℃水浴中摇晃浸提大约4h左右，或辅以频率为20KHz的超声波预处理45min，过滤，旋转蒸发回收乙醇；C、固相萃取：将上述大豆皂苷提洗脱液加入装有大孔吸附树脂的吸附柱中，室温下，流速控制在0.5-2.0BV/h；1-5BV的去离子水，室温下，流速控制在0.5-2.0BV/h洗脱杂质；3-5BV的≥95％的低级醇于室温下2.0-5.0BV/h冲洗吸附柱，旋转蒸发回收低级醇得洗脱液；洗脱液冻干得到大豆皂苷和大豆异黄酮粗提物粉末。3.根据权利要求1所述的高纯度DDMP大豆皂苷单体分离制备的方法，其特征是，步骤②中所述的大豆皂苷粗分离，其制备方法为：选择上相为固定相，下相为流动相的溶剂体系，加入体积百分比3.0-5.0％的乙酸，以助于洗脱，体系中各组分按选定正丁醇-水体积比＝1∶1，或乙酸乙酯∶丁醇∶甲醇∶水体积比＝3-4∶0.5-1.0∶1∶5.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵大云，严明霞，黄玉艾，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]