【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于质量，具体涉及基于特异性马铃薯球炭疽菌pcr检测引物及定量检测方法与应用。
技术介绍
1、随着宁夏马铃薯种植面积的不断扩大，马铃薯轮作倒茬年限逐渐缩短，加之不适当的灌溉措施，造成了马铃薯土传病害发生逐年加重，其中马铃薯炭疽病(potato blackdot)在宁夏马铃薯主产区已普遍发生，发病率在20～100％。马铃薯炭疽病较难防治，主要原因有以下几点：首先，马铃薯炭疽病具有潜伏性感染特征，发病的植株和块茎在早期田间症状不易观察到，直至马铃薯植株开始衰老或块茎入窖后，症状才开始显现；其次，叶片上的斑点症状往往与早疫病、黄萎病、自然衰老和缺氮症状混淆，块茎症状与黑痣病等病害症状混淆；第三，病原菌可产生微菌核在土壤中长期存活，且抗逆能力强，在适宜的气候条件下可迅速蔓延。因此，马铃薯炭疽病已成为宁夏马铃薯病虫害防治的瓶颈，严重影响着马铃薯产量和品质，是当前宁夏马铃薯产业发展中亟需解决的问题。
2、针对马铃薯炭疽病，目前尚无抗病品种和有效的防治手段。因此，在种植前检测田间土壤中马铃薯炭疽病菌密度，评估马铃薯炭疽病发生风险，避免高度感染的田地种植，提出预防措施等，显得尤为重要。实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)技术是一种能够快速准确检测土壤中含量较低病原体的定量方法，可解决流行学定量研究中用传统分离鉴定方法难以解决的问题，为病害防控提供科学依据。马铃薯炭疽病作为一种较难防治的土传病害，能够快速准确地定量土壤中马铃薯炭疽菌的密度，是该病害预测和防治必不可少的组成部分。
3、本专利技术针对马铃薯炭疽病发生严重，且尚无好的抗病品种和有效的防治方法的现实，通过构建快速、稳定、准确的定量检测土壤中马铃薯炭疽病菌密度的实时定量pcr检测方法，并进行土壤中带菌量测定，旨在为马铃薯炭疽病早期快速检测与病害预防技术提供依据。本专利技术将为宁夏地区马铃薯品种的合理布局和病害防治提供理论依据，达到长期、有效地控制该病害的目的，为宁夏马铃薯产业提质增效和可持续发展提供强有力的科技支撑。
技术实现思路
1、基于以上现有技术，本专利技术通过设计特异性引物，利用sybr green i实时定量pcr法，构建快速、稳定、准确的定量检测土壤中马铃薯炭疽病菌密度的实时定量pcr检测方法，并进行土壤中带菌量测定，旨在为马铃薯炭疽病早期快速检测与病害预防技术提供依据，为宁夏地区马铃薯品种的合理布局和病害防治提供理论依据，达到长期、有效地控制该病害的目的，为我区马铃薯产业提质增效和可持续发展提供强有力的科技支撑。
2、为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、基于特异性马铃薯球炭疽菌的特异性序列而设计的pcr检测引物为ggsf6/ggsr6，引物ggsf6序列为5′-cctcccccaagtcttt-3′，引物ggsr6序列为5′-cgcgaacggtttcccc-3′。
4、进一步的，具体步骤包括(1)引物设计与特异性检测：基于球炭疽菌的四个基因序列设计特异性引物，进行pcr扩增，筛选出球炭疽菌特异性引物，并进行特异性检测；(2)定量检测方法建立：利用筛选出的特异性引物进行进行质粒标准品制备，优化qpcr反应条件，建立qpcr标准曲线，并进行灵敏度和重复性检测；(3)方法验证：利用普通pcr和qpcr检测法，对接入土壤中不同浓度的病原菌进行检测验证。
5、进一步的，步骤(1)中基于球炭疽菌四个基因序列筛选的特异性基因片段为谷氨酰胺合成酶(gs)，片段大小907bp。
6、进一步的，，步骤(1)中筛选的特异性基因片段谷氨酰胺合成酶(gs)设计检测马铃薯炭疽病菌(c.coccodes)的特异性引物为引物ggsf6/ggsr6，目的片段长度为322bp，
7、引物ggsf6序列为5′-cctcccccaagtcttt-3′，
8、引物ggsr6序列为5′-cgcgaacggtttcccc-3′。
9、进一步的，步骤(2)中质粒标准品制备时采用特异性引物为ggsf6/ggsr6进行扩增，优化qpcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度60℃50s，72℃延伸50s，40个循环，72℃延伸10min，12℃保存；
10、pcr反应体系为：10×pcr buffer、10mmol/l d ntp、5u/μl taq plus dnapolymerase、50mmol/l mgso4共12.5μl，dna模板1.0μl，引物f(10mmol/l)1.0μl，引物r(10mmol/l)1.0μl，加ddh2o 9.5μl到25μ。
11、进一步的，步骤(2)中最佳退火温度为60℃；含有目的条带的重组质粒标准曲线y＝-3.4614x+30.516，相关系数r2为0.9943，扩增效率为94.49％，对球炭疽菌的检测下限为2.99×10-1copies·μl-1，比常规pcr检测灵敏度高1000倍，具有较好的灵敏性和重复性。
12、进一步的，步骤(3)中使用优化的qpcr反应条件，对不同浓度带菌土壤dna进行荧光定量pcr，得到土壤带菌量与目的基因拷贝数的线性方程y＝0.4987x+0.045，相关系数r2为0.9913，土壤带菌量检测下限为2ng·g-1。
13、进一步的，引物ggsf6/ggsr6应用于马铃薯球炭疽菌的检测。
14、进一步的，用以确定马铃薯炭疽菌适宜的生长条件。
15、有益效果
16、本专利技术的有益效果如下：
17、(1)马铃薯炭疽病已成为宁夏马铃薯病虫害防治的瓶颈，严重影响着马铃薯产量和品质，是当前宁夏马铃薯产业发展中亟需解决的问题；本专利技术通过建立快速、稳定、准确的定量检测土壤中马铃薯炭疽病菌密度的实时定量pcr检测方法，为宁夏地区马铃薯炭疽病防控技术提供理论依据，以解决当前宁夏马铃薯产业发展中亟需解决的瓶颈问题，为我区马铃薯产业提质增效和健康发展提供强有力的科技支撑。
18、(2)本专利技术具有非常重要的现实意义，马铃薯炭疽病作为一种较难防治的土传病害，能够快速准确地定量土壤中马铃薯炭疽菌的密度，是该病害预测和防治必不可少的组成部分，因此本专利技术是保障马铃薯有效供给和质量安全的关键抓手，是实现我区马铃薯产业可持续发展的必然途径。
19、(3)本专利技术对马铃薯炭疽病的定量快速检测提供了快速、稳定的方法，定量检测土壤中马铃薯炭疽病菌密度的实时定量pcr检测方法，并进行土壤中带菌量测定，为马铃薯炭疽病早期快速检测与病害预防技术提供依据，在马铃薯的病害防治具有重要的作用。
20、(4)马铃薯炭疽菌的检测由于精度高可以用以确定马铃薯炭疽菌适宜的生长条件。
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1.基于特异性马铃薯球炭疽菌的特异性序列而设计的PCR检测引物为Ggsf6/Ggsr6，其特征在于引物Ggsf6序列为5′-CCTCCCCCAAGTCTTT-3′，引物Ggsr6序列为5′-CGCGAACGGTTTCCCC-3′。
2.基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，具体步骤包括(1)引物设计与特异性检测：基于球炭疽菌的四个基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，筛选出球炭疽菌特异性引物，并进行特异性检测；(2)定量检测方法建立：利用筛选出的特异性引物进行进行质粒标准品制备，优化qPCR反应条件，建立qPCR标准曲线，并进行灵敏度和重复性检测；(3)方法验证：利用普通PCR和qPCR检测法，对接入土壤中不同浓度的病原菌进行检测验证。
3.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中基于球炭疽菌四个基因序列筛选的特异性基因片段为谷氨酰胺合成酶(GS)，片段大小907bp。
4.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中筛选的特异性基因片段谷氨酰胺
5.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中质粒标准品制备时采用特异性引物为Ggsf6/Ggsr6进行扩增，优化qPCR反应条件为95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度60℃50s，72℃延伸50s，40个循环，72℃延伸10min，12℃保存；
6.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中最佳退火温度为60℃；含有目的条带的重组质粒标准曲线y＝-3.4614x+30.516，相关系数R2为0.9943，扩增效率为94.49％，对球炭疽菌的检测下限为2.99×10-1copies·μL-1，比常规PCR检测灵敏度高1000倍，具有较好的灵敏性和重复性。
7.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中使用优化的qPCR反应条件，对不同浓度带菌土壤DNA进行荧光定量PCR，得到土壤带菌量与目的基因拷贝数的线性方程y＝0.4987x+0.045，相关系数R2为0.9913，土壤带菌量检测下限为2ng·g-1。
8.引物Ggsf6/Ggsr6应用于马铃薯球炭疽菌的检测。
9.根据权利要求2所述的引物Ggsf6/Ggsr6应用于马铃薯球炭疽菌的检测，其特征在于，用以确定马铃薯炭疽菌适宜的生长条件。
...【技术特征摘要】
1.基于特异性马铃薯球炭疽菌的特异性序列而设计的pcr检测引物为ggsf6/ggsr6，其特征在于引物ggsf6序列为5′-cctcccccaagtcttt-3′，引物ggsr6序列为5′-cgcgaacggtttcccc-3′。
2.基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，具体步骤包括(1)引物设计与特异性检测：基于球炭疽菌的四个基因序列设计特异性引物，进行pcr扩增，筛选出球炭疽菌特异性引物，并进行特异性检测；(2)定量检测方法建立：利用筛选出的特异性引物进行进行质粒标准品制备，优化qpcr反应条件，建立qpcr标准曲线，并进行灵敏度和重复性检测；(3)方法验证：利用普通pcr和qpcr检测法，对接入土壤中不同浓度的病原菌进行检测验证。
3.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中基于球炭疽菌四个基因序列筛选的特异性基因片段为谷氨酰胺合成酶(gs)，片段大小907bp。
4.根据权利要求2所述的基于特异性马铃薯球炭疽菌的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中筛选的特异性基因片段谷氨酰胺合成酶(gs)设计检测马铃薯炭疽病菌(c.coccodes)的特异性引物为引物ggsf6/ggsr6，目的片段长度为322bp，
5.根据权利要求2所述的基于...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭成瑾，王喜刚，郭荣君，王玲，沈瑞清，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院植物保护研究所宁夏植物病虫害防治重点实验室，
类型：发明
国别省市：
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