【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及双特异性嵌合抗原受体和免疫细胞、制备方法、应用及肿瘤治疗药品。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法，简称car-t技术，是通过体外改造病人的t细胞，使病人的t细胞具备识别肿瘤细胞的能力，体外扩大培养后回输到病人体内进行治疗的一种方法。在car-t疗法的领域中，对于血液肿瘤效果最为显著，car-t疗法在治疗难治复发性b细胞急性淋巴细胞白血病时可以达到约90％完全缓解率，而在治疗b细胞淋巴瘤时可以达到约70％完全缓解率。除此之外，部分临床显示，大约有20％的患者接受car-t治疗后可以获得长期生存，car-t疗法对于血液肿瘤展现出令人惊叹疗效，但在实体瘤治疗效果上仍需改进。
2、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，提供一种双特异性嵌合抗原受体和免疫细胞、制备方法、应用及肿瘤治疗药品，其具有良好的实体瘤治疗效果。
2、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了双特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体含有b细胞表面抗原结合分子结构域和肿瘤抗原结合分子结构域；所述肿瘤为实体瘤；
4、所述b细胞表面抗原结合分子结构域与肿瘤抗原结合分子结构域经连接肽串联。
5、本专利技术的专利技术人发现，血液肿瘤和实体瘤最主要的区别就是实体瘤有固定的生长地方，血液中没有或者非常少的肿瘤细胞；而血液瘤的肿瘤细胞是大多数都是在血液中循环的
6、本文中“car”、“嵌合抗原受体”，是人工改造受体，例如其包括能够将识别肿瘤细胞表面抗原或病毒抗原的特异性分子(如抗体或其抗原结合片段)锚定在免疫效应细胞(如t细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原并杀死肿瘤细胞或病毒的受体。表达car的t细胞称为car-t(或cart)。通常，嵌合抗原受体依次包含胞外结构域、跨膜区域和胞内信号结构域。可采用本领域已知的用于构建car的跨膜区域和胞内信号结构域来构建本专利技术的嵌合抗原受体。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，可以通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域再将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞通过分泌穿孔素或者产生细胞因子杀伤肿瘤细胞，同时效应细胞本身也发生扩增，进一步扩大免疫杀伤作用。胞外结构域可包含抗原结合结构域(特异性结合抗原的抗体部分)，抗原结合结构域可以是特异性结合抗原的单链可变区片段(也即single-chainvariable fragment，scfv或单链抗体)。单链可变区片段可作为car的胞外结构域，该结构域决定car-免疫细胞的特异性。铰链区(hinge)通常由一段起连接作用的肽构成，例如铰链区连接car的单链抗体和跨膜结构域，它通常维持效应细胞中稳健的car表达和活性所需的稳定性，大多数car的铰链区由igg的铰链或cd8α/cd28胞外区衍变而来。跨膜结构域将car的细胞外结构域与细胞内信号转导结构域连接。常用的跨膜结构域例如来源于cd4，cd8α，cd28和cd3ζ。跨膜结构域的选择可影响car结构在细胞功能上的活化程度。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。“共刺激分子”或“共刺激信号传导结构域”是存在于抗原提呈细胞表面，能与th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。t淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子信号。共刺激信号传递给t细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子cd80、cd86与t细胞表面的cd28分子结合。b细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如lps，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的th细胞表面的cd40l。可采用本领域已知的用于构建car的共刺激分子，包括但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、b7-h3、cd16、nkp44、nkp46、dnam-1、nkg2d和/或它们的任何组合。
7、本专利技术提供的双特异性嵌合抗原受体能够靶向b细胞和实体瘤细胞。而将该嵌合抗原受体转化进免疫细胞制备得到的car细胞在施用进入机体内后，能够被体内b细胞刺激激活，使car细胞在体内大量增殖，避免在接触肿瘤细胞前，过早凋亡。而后在接触肿瘤细胞后，对肿瘤细胞进行杀伤，实现良好的治疗效果。从而解决car细胞在治疗肿瘤患者时由于体内car细胞如car-t细胞数量不足而导致的疗效不佳的问题。
8、将b细胞表面抗原结合分子结构域与肿瘤抗原结合分子结构域经连接肽串联构建在同一个car上，该设计结构相较于将不同抗原结合结构域分别设计在不同car上的设计结构，可避免或减少car细胞在表达car时抗原结合结构域表达不完全的情况，提高双阳性率，提高实体瘤治疗效果。
9、在可选的实施方式中，前述实施方式所述b细胞表面抗原结合分子包括抗b细胞表面抗原的scfv分子，所述肿瘤抗原结合分子包括抗肿瘤抗原的scfv分子。
10、术语“scfv”、“单链抗体”是包含轻链可变区和重链可变区的融合蛋白，其中轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)通过连接肽连接，能够表达为单链多肽，并且scfv保持其所源自的完整抗体的抗原结合活性。除非特别指出，否则在本文中scfv可以以任何一种顺序具有vl和vh可变区，例如scfv多肽的n端至c端，可以包含：a)vl-接头-vh或b)vh-接头-vl。
11、术语“连接子”、“连接肽”、“连接多肽”、“linker”或“接头”指连接两个多肽片段的连接单元，通常具有一定的柔性，接头的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。连接子可以是肽连接子，其包含一个或多个氨基酸，典型的约1-30个、2-24个或3-15个氨基酸；在一些实施方案中，所述连接子为选自(gxs)y连接子，其中，x选自1-5的整数，y选自1-6的整数。
12、在可选的实施方式中，前述实施方式所述串联方式为(a)～(d)中任一种：
13、(a)所述抗b细胞表面抗原的scfv分子的重链可变区与抗肿瘤抗原的scfv分子的重链可变区经连接肽串联；
14、(b)所述抗b细胞表面抗原的scfv分子的重链可变区与抗肿瘤抗原的scfv分子的轻链可变区经连接肽连接；
15、(c)所述抗肿瘤抗原的scfv分子的轻链可变区与抗肿瘤抗原的scfv分子的重链可变区经连接肽连接本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有B细胞表面抗原结合分子结构域和肿瘤抗原结合分子结构域；所述肿瘤为实体瘤；
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述B细胞表面抗原结合分子包括抗B细胞表面抗原的scFv分子，所述肿瘤抗原结合分子包括抗肿瘤抗原的scFv分子。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述串联方式为(a)～(d)中任一种：
4.根据权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述B细胞表面抗原选自CD19、BCMA、CD20或CD22。
5.根据权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述实体瘤选自间皮瘤、胃肠道腺瘤、肝细胞癌、胶质瘤、膀胱癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、大肠癌、食道癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺肿瘤、尿路上皮癌、肾癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、转移性癌症、胆管癌、淋巴瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肉瘤、肺癌、胰腺肿瘤、卵巢透明细胞癌、非小细胞肺癌、星形细胞瘤、肝癌、结肠癌、卵黄囊癌、视网膜母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、胸腺癌
6.根据权利要求2～5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗B细胞表面抗原的scFv分子为靶向CD19的scFv分子；所述抗肿瘤抗原的scFv分子为靶向GUCY2C的scFv分子或靶向MSLN的scFv分子；
7.根据权利要求1～6任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括信号肽结构域和跨膜结构域；
8.生物材料，其特征在于，包括以下(ⅰ)～(Ⅳ)任一项：
9.权利要求8所述生物材料(ⅰ)～(ⅲ)任一项在制备嵌合抗原受体细胞中的应用。
10.双特异性嵌合抗原受体细胞的制备方法，其特征在于，包括将编码权利要求1～7任一项所述嵌合抗原受体的DNA分子插入慢病毒载体得到重组载体，而后转染宿主细胞包装成慢病毒，再使用慢病毒转化免疫细胞得到双特异性嵌合抗原受体细胞；
11.权利要求1～7任一项所述嵌合抗原受体、权利要求8所述生物材料或采用权利要求10所述制备方法得到的双特异性嵌合抗原受体细胞在制备肿瘤治疗药品中的应用。
12.肿瘤治疗药品，其特征在于，含有权利要求8所述(Ⅳ)嵌合抗原受体细胞或采用权利要求10所述制备方法得到的双特异性嵌合抗原受体细胞。
...【技术特征摘要】
1.双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有b细胞表面抗原结合分子结构域和肿瘤抗原结合分子结构域；所述肿瘤为实体瘤；
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述b细胞表面抗原结合分子包括抗b细胞表面抗原的scfv分子，所述肿瘤抗原结合分子包括抗肿瘤抗原的scfv分子。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述串联方式为(a)～(d)中任一种：
4.根据权利要求1～3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述b细胞表面抗原选自cd19、bcma、cd20或cd22。
5.根据权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述实体瘤选自间皮瘤、胃肠道腺瘤、肝细胞癌、胶质瘤、膀胱癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、大肠癌、食道癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺肿瘤、尿路上皮癌、肾癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、转移性癌症、胆管癌、淋巴瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肉瘤、肺癌、胰腺肿瘤、卵巢透明细胞癌、非小细胞肺癌、星形细胞瘤、肝癌、结肠癌、卵黄囊癌、视网膜母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、胸腺癌、或乳腺癌；
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王先进，彭亮，叶立军，
申请(专利权)人：深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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