【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白改造，涉及一种二氢叶酸还原酶突变体及其制备方法、应用和6s-5-甲基四氢叶酸钙的制备方法。
技术介绍
1、6s-5-甲基四氢叶酸是叶酸的一种生物活性形式，占血浆中叶酸总含量的90％以上。研究表明，叶酸缺乏会引发巨幼细胞贫血、神经管缺陷等疾病。人自身无法合成叶酸，只能从外部摄入。相较于直接补充叶酸，6s-5-甲基四氢叶酸可以降低代谢损失，有更好的生物利用率。市售的6s-5-甲基四氢叶酸主要以钙盐形式居多，目前6s-5-甲基四氢叶酸钙的合成工艺以化学合成为主，即合成消旋5-甲基四氢叶酸，再进一步拆分得到6s-5-甲基四氢叶酸，但拆分过程易引入杂质，导致产品纯度低、生产污染大等问题。酶法合成是利用二氢叶酸还原酶催化合成得到6s-四氢叶酸，进而直接得到6s-5-甲基四氢叶酸。酶法合成不需要复杂的拆分过程且污染更小，是一种理想的生产方法。除辅酶nadph价格高之外，二氢叶酸还原酶活性低、用量大，也会造成成本高及后续纯化难度增大等问题。辅酶再生系统是利用价格相对低廉的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖再生nadph，可以降低nadph的用量和成本，因此得到高活性的二氢叶酸还原酶，是实现酶法合成6s-5-甲基四氢叶酸工业化的关键。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种二氢叶酸还原酶突变体及其制备方法和应用。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种二氢叶酸还原酶突变体，所述二氢叶酸还原酶突变体为在氨基
4、在本专利技术中，为了实现绿色高效合成6s-5-甲基四氢叶酸钙，对二氢叶酸还原酶进行了人工定向改造，显著提高了其对二氢叶酸的还原活性，有助于实现酶法生产6s-四氢叶酸的工业化，得到的6s-四氢叶酸可以直接合成光学纯的6s-5-甲基四氢叶酸钙，不用后续复杂的拆分，对于实现6s-5-甲基四氢叶酸钙的绿色高效生产具有重要意义。
5、在本专利技术中，所述seq id no.1为如下的氨基酸序列：
6、mgsvakvififamdlsgkiassfsgwnspedrkhfrevtteignvvmgritfeeigkplpgrlnvvltknrktssdpslvffngspkdvveflegkgyrevaviggrtvftqflreklvdemfitiepylfgrgvpffsefdgfftlklleisklnekgtlflkysvehshr。
7、在本专利技术中，所述二氢叶酸还原酶的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列。
8、seq id no.2：
9、atgggtagtgttgccaaagtgatttttatcttcgcaatggatctgagtggtaaaattgcaagtagctttagtggctggaatagtccggaagatcgcaaacattttcgcgaagttaccaccgaaattggtaatgttgttatgggtcgcattacctttgaagaaattggtaaaccgctgccgggtcgtctgaatgttgttctgaccaaaaatcgcaaaaccagtagcgatccgagtctggtgttttttaatggcagtccgaaagatgttgtggaatttctggaaggcaaaggttatcgcgaagtggccgttattggtggccgtaccgtttttacccagtttctgcgcgaaaaactggtggatgaaatgtttattaccatcgaaccgtacctgtttggtcgcggcgtgcctttttttagtgaatttgatggcttcttcaccctgaaactgctggaaattagcaaactgaatgagaaaggcaccctgtttctgaaatatagtgttgaacacagccaccgttaa。
10、优选地，所述二氢叶酸还原酶来源于thermotoga neapolitana。
11、第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的二氢叶酸还原酶突变体。
12、第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
13、第四方面，本专利技术提供了一种二氢叶酸还原酶突变体转化子，所述二氢叶酸还原酶突变体转化子为表达第一方面所述的二氢叶酸还原酶突变体的基因工程菌株。
14、优选地，所述二氢叶酸还原酶突变体转化子含有第二方面所述的核酸分子。
15、优选地，所述二氢叶酸还原酶突变体转化子含有第三方面所述的表达载体。
16、第五方面，本专利技术提供了一种第一方面所述的二氢叶酸还原酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：
17、构建表达载体，转化至受体细胞中，构建二氢叶酸还原酶突变体转化子；培养所述二氢叶酸还原酶突变体转化子，收集培养物，筛选酶活较高的突变体，得到所述二氢叶酸还原酶突变体。
18、在本专利技术中，所述构建表达载体包括以下步骤：采用大分子建模技术预测出对二氢叶酸还原酶活有益的突变位点为e37和k57，然后以tndhfr-pet28a(+)重组质粒为模版，分别对两个位点进行定点饱和突变。
19、优选地，所述e37位突变上游引物为：acattttcgcnnkgttaccaccgaaattggta，下游引物为：cggtggtaacmnngcgaaaatgtttgcgatct。
20、优选地，所述k57位点突变上游引物为：agaaattggtnnkccgctgccgggtcgtctga，下游引物为：ccggcagcggmnnaccaatttcttcaaaggta。
21、在本专利技术中所述构建二氢叶酸还原酶突变体转化子，培养所述二氢叶酸还原酶突变体转化子的过程具体为：将表达载体转化宿主菌后，接种含有50mg/l硫酸卡那霉素的lb培养基中，于37℃培养过夜。过夜菌液再转接至新鲜的含50mg/l硫酸卡那霉素的lb培养基中，在37℃继续培养至od600＝0.8，加入终浓度为0.1mmol的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导，25℃继续培养16小时。培养结束后在4℃、10000rpm离心10min收集菌泥，重新分散至磷酸钠缓冲液(50mm，ph 7.5)中，冰浴中超声破碎细胞，纯化后获得纯酶液。
22、在本专利技术中，所述筛选酶活较高的突变体的过程具体为：向含有0.5mm dhf，0.5mmnadph、1mm二硫代苏糖醇(dtt)、50mm磷酸钾缓冲液(ph7.4)中加入10μl酶液，在30℃条件下检测340nm处吸光值的变化，酶活力(u)单位定义为：在上述条件下，每分钟氧化1μmolnadph所需的酶量。筛选出酶活较高的突变体。
23、在本专利技术中，当第37位谷氨酸(e)替换为赖氨酸(k)，第57位赖氨酸(k)替本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种二氢叶酸还原酶突变体，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶突变体为在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生了突变的二氢叶酸还原酶；所述突变类型包括E37K和/或K57R。
2.根据权利要求1所述的二氢叶酸还原酶突变体，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的二氢叶酸还原酶突变体。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的核酸分子。
5.一种二氢叶酸还原酶突变体转化子，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶突变体转化子为表达如权利要求1或2所述的二氢叶酸还原酶突变体的基因工程菌株；
6.根据权利要求1或2所述的二氢叶酸还原酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，述构建表达载体包括以下步骤：采用大分子建模技术预测出对二氢叶酸还原酶活有益的突变位点为E37和K57，然后以TnDHFR-pET28a(+)重组质
8.一种如权利要求1或2所述的二氢叶酸还原酶突变体在催化合成6S-四氢叶酸反应中的应用。
9.一种6S-四氢叶酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
10.一种6S-5-甲基四氢叶酸钙的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种二氢叶酸还原酶突变体，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶突变体为在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生了突变的二氢叶酸还原酶；所述突变类型包括e37k和/或k57r。
2.根据权利要求1所述的二氢叶酸还原酶突变体，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列；
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的二氢叶酸还原酶突变体。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的核酸分子。
5.一种二氢叶酸还原酶突变体转化子，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶突变体转化子为表达如权利要求1或2所述的二氢叶酸还...
【专利技术属性】
技术研发人员：王炳荣，林开家，徐飞，邢小飞，徐晓彤，
申请(专利权)人：金达威生物技术江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：
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