【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白改造，涉及一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和nadh的制备方法。
技术介绍
1、手性醇、非天然氨基酸及其衍生物在食品、医药和化工工业有巨大的应用前景。近年来，这些产物的非对称还原也颇受关注。在还原的过程中需要消耗大量昂贵的nadh或nadph，为了降低生产成本，提高辅酶循环效率一直是非对称氧化还原领域需要关注的焦点。迄今为止，在生物转化的辅酶再生体系中，葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶是两种应用最为广泛的辅酶再生酶。葡萄糖脱氢酶通过氧化葡萄糖来进行nadh或nadph的再生，有葡萄糖酸等副产物生成，会加大后续处理工艺的难度。甲酸脱氢酶(formate dehydrogenases，fdh)能催化甲酸氧化生成二氧化碳，同时能将nad+还原成nadh，在nadh的再生中起重要的作用。此外，甲酸脱氢酶介导的nadh再生没有任何副产物的产生。因此，甲酸脱氢酶更适合于nadh的再生。
2、甲酸脱氢酶广泛存在于甲基营养型微生物中，如可以利用甲醇的酵母菌以及一些细菌等，最具代表性的是来源于博伊丁假丝酵母(candida boidinii)的甲酸脱氢酶cbfdh，已成功用于与l-亮氨酸脱氢酶偶联进行手性纯l-叔亮氨酸的工业化生产。然而，野生型的cbfdh酶活性低，与其它氧化还原酶偶联时，辅酶nadh的再生能力不足，制约了产品的转化效率。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和nadh的制备方法。本专利技术采
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一方面，本专利技术提供一种甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体为在seq idno.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；
4、所述氨基酸突变的类型包括k212l和/或a347v。
5、在本专利技术中，通过在甲酸脱氢酶中引入如上所述突变，显著提高了甲酸脱氢酶的催化活力，从而提高nadh的生产和再生效率。
6、在本专利技术中，所述seq id no.1所示的氨基酸序列如下：
7、makvlcvlyddpvdgypttyarddlptverygdgqslptptaidfvpgt
8、mlgsvsgelglrkylesnghtlvvtsdkdgpdsvfereladadvvisqpfwp
9、ayltadriakapnlklaltagigsdhvdlqaamdsgvtvaevtycnsisvae
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15、优选地，所述甲酸脱氢酶的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列。
16、seq id no.2：
17、atggctaaagttctgtgcgttctgtacgacgacccggttgacggttacccgaccacctacgctcgtgacgacctgccgaccgttgaacgttacggtgacggtcagtctctgccgaccccgaccgctatcgacttcgttccgggtaccat gctgggttctgtttctggtgaactgggtctgcgtaaatacctggaatctaacggtcacaccctggttgttacctctgacaaagacggtccggactctgttttcgaacgtgaactggctgacgctgacgttgttatctctcagccgttctggccggcttacctgaccgctgaccgtatcgctaaagctccgaacctgaaactggctctgaccgctggtatcggttctgaccacgttgacctgcaggctgctatggactctggtgttaccgttgctgaagttacctactgcaactctatctctgttgctgaacacgttgttatgatgatcctgggtctggttcgtaactacctgccgtctcacgaatgggttaccaaaggtggttggaacatcgctgactgcgttgctcgttcttacgacgttgaaggtatgcacgttggtaccgttgctgctggtcgtatcggtctggctgttctgcgtcgtctgaaaccgttcggtatgcacctgcactacaccgaccgtcaccgtctgccggaatctgttgaagaagaactgggtctgatctggcacccgtctccggaagacatgtacccgaactgcgacgttgttaccctgaactgcccgctgcacccggaaaccgaacacatggttaacgaagaaaccctgaaactgttcaaacgtggtgcttacctggttaacaccgctcgtggtaaactgtgcgaccgtgacgctatcgttcgtgctctggaagacggtcgtctggctggttacgctggtgacgtttggttcccgcagccggctccggaagaccacccgtggcgttctatgccgaaccacggtatgaccccgcacatctctggtacctctctgtctgctcagacccgttacgctgctggtacccgtgaaatcctggaatgcttcttcgaaggtcgtccgatccgtgacgaatacctgatcgttgactctggtgctctggctggtgttggtgctcactcttactctgctggtaacgctaccgacggttctgaagaagctgctaaattcaaacagcgttaa。
18、在本专利技术中，所述甲酸脱氢酶来源于红球菌属(rhodococcus sp.jt-3)。
19、第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体。
20、第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
21、第四方面，本专利技术提供了一种甲酸脱氢酶突变体转化子，所述甲酸脱氢酶突变体转化子为表达第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶来源于红球菌属Rhodococcus sp.JT-3。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种甲酸脱氢酶突变体转化子，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体转化子为表达如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌株；
7.一种如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
8.一种如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体在NADH再生和制备反应中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体为在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶来源于红球菌属rhodococcus sp.jt-3。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐飞，祝俊，张超，张兴意，纪欣，甄明，
申请(专利权)人：金达威生物技术江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：
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