【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白改造，涉及一种磷脂酶d突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法。
技术介绍
1、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称ps)又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜的内层，磷脂化学物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统，是大脑的细胞膜的重要组成成分之一，同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用，如它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。具有重要的功能与作用，例如延缓衰老、维持机体健康年轻、强化脑部功能、增强记忆力、治疗多动症儿童、促进血液循环、分解过高的血脂和过高的胆固醇、清扫血管，使血管顺畅，从而减轻脂肪肝的发病率，有“血管清道夫”的美誉。
2、目前工业化生产磷脂酰丝氨酸的制备方法主要有提取法和酶转化法，其中提取法主要是从植物细胞、动物的卵磷脂中提取ps，植物中的ps含量较少，所以提取法以动物的卵磷脂中提取为主，从动物中提取主要是动物的大脑及内脏，目前国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家禽的动物脑为原料来提取ps。近年来，由于疯牛病的等动物疾病的原因，利用动物细胞提取ps的方法，其提取的产品的安全性受到人们的怀疑，现在已处于淘汰边缘。
3、酶转化法主要是以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，利用磷脂酶d(phospholipase d，英文简称pld)，在双相体系(水相-有机相)或纯水相体系催化生成磷脂酰丝氨酸，然而，磷脂酶d的低表
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种磷脂酶d突变体及其制备方法、应用和磷脂酰丝氨酸的制备方法。本专利技术的种磷脂酶d突变体转磷脂酰基催化活力能力提高，从而提高催化合成磷脂酰丝氨酸的反应速率，大大降低生产成本，实现磷脂酶d在工业上的应用，提高磷脂酰丝氨酸的产量和收率。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种磷脂酶d突变体，所述磷脂酶d突变体为在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上发生了氨基酸突变的磷脂酶d；
4、所述氨基酸突变的类型包括l87e、g379q、l461d中的任意一种或至少两种的组合。
5、本专利技术中，通过在磷脂酶d中引入上述突变，显著提高了磷脂酰转移活性，相比于原始的磷脂酶d，所述磷脂酶d突变体的相对酶活可高达400％，使得磷脂酰丝氨酸在温和的反应条件生成，降低了生产成本以及生产的难度，提高了生产效率，具有实际应用的价值。
6、在本专利技术中，seq id no.1所示的氨基酸序列如下：
7、apsptphldsieqtlrqvspglegsvwertsgnrlgsstpggadwllqtpgcwgdaactdrpgsrrlldkmrqdvaaaretvdistlapfpnggyqdaivaglkesvqkgnrlkvrimvgaapvyhstvipssyrdellaklgpaaaaditlnvasmttsktsfswnhsklivvdgssvitgginswkddyldtthpvadvdlalsgpaagsagryldtlwdwtcrnksswssvwfaaspgadcmpslprpaspagggdvpalavgglgvgirqndpasafrpvlptardtkcgiglpdrtnadrdydtvnpeesalralvagatshieisqqdihatcpplprydvrlydalaaklvsgvkvrivvsdpanrgtigsggysqitslnevsdalrgrvaaltgdgarartamcenlqlatfrasdrptwadgkpyaqhhklvsvdgsafyigsknlypswlqdfgyivespaaagqlksdlldpqwrysqatatydytrglcqg。
8、优选地，所述磷脂酶d突变体为l87e、g379q、l461d、l87e/g379q、g379q/l461d、l87e/l461d或l87e/g379q/l461d。
9、在本专利技术中，所述l87e/g379q突变体代表在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上发生了87位和379位氨基酸突变得到的突变体，g379q/l461d、l87e/l461d或l87e/g379q/l461d具有相似的含义，不再赘述。
10、优选地，所述磷脂酶d的编码序列包括seq id no.2所示的核苷酸序列。
11、seq id no.2：
12、gctccatctccaactccacatttggactccatcgagcaaaccctgagacaagtttccccaggattggaaggttccgtttgggaaagaacctccggtaacagactgggttcttctactccaggaggagcagattggttgttgcaaactccaggttgttggggagacgcagcttgtacagatagaccaggttccagaagactgctggataagatgagacaggacgttgcagcagctagagaaaccgttgacatctccactttggctccattcccaaacggaggttaccaagacgctatcgttgccggtttgaaggaatccgttcagaagggtaacagactgaaggtcagaatcatggtcggagcagctccagtttaccattctaccgttatcccatcctcctacagagacgagttgttggctaagttaggtccagcagcagcagcagatatcactttgaacgtcgcttccatgaccacctcaaagacctccttctcttggaaccactccaagctgatcgttgttgacggttcctccgttatcaccggaggtatcaactcttggaaggacgactacttggacactactcatccagttgccgacgttgatttggctttgtcaggaccagctgctggttcagcaggtagatacttggataccctttgggattggacttgcagaaacaagtcctcttggtcctccgtttggtttgcagcttctccaggagcagattgtatgccatctttgccaagaccagcttcaccagcaggaggaggagacgttcctgctttagcagttggaggtttgggagttggtatcagacagaacgatccagcttccgctttcagaccagttttgccaaccgctagagacactaagtgcggtatcggtttgccagatagaactaacgccgacagagactacgataccgttaacccagaggagtcagctttgagagctttggttgcag本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述磷脂酶D突变体为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上发生了氨基酸突变的磷脂酶D；
2.根据权利要求1所述的磷脂酶D突变体，其特征在于，所述磷脂酶D突变体为L87E、G379Q、L461D、L87E/G379Q、G379Q/L461D、L87E/L461D或L87E/G379Q/L461D；
3.根据权利要求1或2所述的磷脂酶D突变体，其特征在于，所述磷脂酶D突变体与磷脂酶D的同源性在80％以上；
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的磷脂酶D突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种磷脂酶D突变体转化子，其特征在于，所述磷脂酶D突变体转化子为表达如权利要求1-3中任一项所述的磷脂酶D突变体的基因工程菌株。
7.根据权利要求6所述的磷脂酶D突变体转化子，其特征在于，所述磷脂酶D突变体转化子含有如权利要求4所述的核酸分子；
8.一种权利要求1-3中
9.一种权利要求1-3中任一项所述的磷脂酶D突变体在催化合成磷脂酰丝氨酸反应中的应用。
10.一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将磷脂酶D突变体添加至含有大豆卵磷脂和L-丝氨酸的反应体系中反应，获得含磷脂酰丝氨酸的反应液；将含磷脂酰丝氨酸的反应液进行提取，获得磷脂酰丝氨酸；
...【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶d突变体，其特征在于，所述磷脂酶d突变体为在seq id no.1所示的氨基酸序列的基础上发生了氨基酸突变的磷脂酶d；
2.根据权利要求1所述的磷脂酶d突变体，其特征在于，所述磷脂酶d突变体为l87e、g379q、l461d、l87e/g379q、g379q/l461d、l87e/l461d或l87e/g379q/l461d；
3.根据权利要求1或2所述的磷脂酶d突变体，其特征在于，所述磷脂酶d突变体与磷脂酶d的同源性在80％以上；
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的磷脂酶d突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸分子。
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐飞，祝俊，张超，张兴意，丁争艳，
申请(专利权)人：金达威生物技术江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：
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