一种单胺氧化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种单胺氧化酶突变体及其应用，所述单胺氧化酶突变体为发生了氨基酸突变的单胺氧化酶；所述单胺氧化酶包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述氨基酸突变的类型包括V239I、N240D、H241C、V243M、N333S、D344S、R345P、H394A、I396K、A397M或Q400E中的任意一种或至少两种的组合。本发明专利技术所述单胺氧化酶突变体的酶活得到了显著提升，降低了(1R,5S)

【技术实现步骤摘要】
一种单胺氧化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白改造
，尤其涉及一种单胺氧化酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]波普瑞韦(Boceprevir)(SCH
‑
503034)由美国先灵葆雅公司研发，于2011年5月13日经美国食品药品管理局(FDA)批准上市，与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联用用于治疗CHC基因Ⅰ型慢性病型肝炎。波普瑞韦为口服的丙型肝炎病毒非结构蛋白3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂，直接作用于病毒蛋白酶，通过与NS3/4ASP结合，发挥抑制病毒复制的作用。
[0003]目前，临床前研究表明波普瑞韦能通过靶向Mpro有效抑制Vero细胞中的新冠病毒的复制。
[0004]波普瑞韦的结构式如下：
[0005][0006](1R,2S,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
羧酸甲酯盐酸盐是合成波普瑞韦重要的中间体，其结构式如下：
[0007][0008]该中间体的合成需要的一个重要的中间体(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯，其结构式如下：
[0009][0010]传统的(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯的化学合成中不仅需要使用昂贵的催化剂Pd
‑
C/Pt
‑
C和硝酸银，而且采用了易燃的氢化铝锂或者K2S2O8，反应时对设备有特殊要求，导致生产成本较高，能耗和设备的占用率高，且反应中容易生成不同手
性的副产品，大大增加了生产成本和后处理成本的同时，还严重影响了产品的收率和生产效益。
[0011]因此，如何提供一种成本低、生产效率高的(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯的合成方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0012]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种单胺氧化酶突变体及其应用，所述单胺氧化酶可以使(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯在低温条件下通过温和反应生成，大大降低了生产成本，并提高了生产效率。
[0013]为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0014]第一方面，本专利技术提供了一种单胺氧化酶突变体，所述单胺氧化酶突变体为发生了氨基酸突变的单胺氧化酶；
[0015]所述单胺氧化酶包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
[0016]所述氨基酸突变的类型包括V239I、N240D、H241C、V243M、N333S、D344S、R345P、H394A、I396K、A397M或Q400E中的任意一种或至少两种的组合。
[0017]SEQ ID No.1：
[0018]MASKDGFSWTKAHGLKTGVPCIGAIEPPSNLKGTDSRFDVIVVGAGYCGLTAARDASLSGLKVLLLEARDRIGGRSWSSNIDGYPYEMGGTWVYWGQANVWREIARYGMQDELEISYDFSRGINQYLLANAQGTQHFSHDEEDDMMESSLSKLVNVDESFGRKVVPFPHSGVLSPEARRYDHMSIADRLAEIKNDLTLNERLCVEAFVLLCSGGTLETTSFYEFLHWWALSGYSYEGCVNHLVKYKFRGGQSSFAIRFFQEALATGNFTYAFSRPVASIKDRGGTVQVTTRDGQTFEAAKMISAIPLNVLSDVTFDPPFTAGRRTAASIGHVNQTVKVHAEISDRDLRSFTGISYPHNGLIYGFGDGETPVGNTHVVAFGGQHNHFHPEDNIDHTIAAFQGFTPMNVERLVFHNWSRDEFAKGAWFFPAPGLLSTYLKDMRARQGNIIFACSDWALGWRSFIDGAIEEGARAAAAVQADLTGRAKL。
[0019]本专利技术中，通过在单胺氧化酶(MAON)中引入上述突变，显著提高了酶的活性，相比于原始的单胺氧化酶，所述单胺氧化酶突变体的相对酶活可达125％以上，甚至高达850％，使得(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯可以在低温条件下以温和的反应条件生成，降低了生产成本以及生产的难度，提高了生产效率，具有实际应用的价值。
[0020]优选地，所述单胺氧化酶的编码序列包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0021]SEQ ID No.2：
[0022]ATGGCCAGTAAAGATGGCTTTAGCTGGACCAAAGCCCATGGCCTGAAAACCGGCGTTCCGTGCATTGGTGCAATTGAACCGCCGAGCAATCTGAAAGGTACCGATAGCCGCTTTGATGTGATTGTTGTGGGCGCCGGCTATTGCGGTCTGACCGCAGCCCGCGATGCCAGTCTGAGTGGTCTGAAAGTGCTGCTGCTGGAAGCACGTGATCGCATTGGTGGTCGCAGTTGGAGTAGCAATATTGATGGCTATCCGTATGAAATGGGCGGCACCTGGGTTTATTGGGGTCAGGCCAATGTTTGGCGCGAAATTGCCCGTTATGGTATGCAGGATGAACTGGAAATTAGTTATGATTTTAGCCGTGGTATTAACCAGTATCTGCTGGCAAATGCCCAGGGCACCCAGCATTTTAGTCATGATGAAGAAGATGATATGATGGAAAGCAGTCTGAGTAAACTGGTGAATGTGGATGAAAGTTTTGGTCGTAAAGTGGTGCCGTTTCCGCATAGCGGTGTTCTGAGTCCGGAAGCCCGTCGCTATGATCACATGAGCATTGCAGATCGCCTGGCCGAAATTAAAAATGATCTGACCCTGAATGAACGCCTGTGTGTTGAAGCCTTTGTGCTGCTGTGTAGCGGTGGTACCCTGGAAACCACCAGCTTTTATGAATTTCTGCATTGGTGGGCACTGAGCGGTTATAGCTATGAAGGCTGCGTGAATCATCTGGTTAAATATAAATTCCGTGGTGGTCA
GAGTAGCTTTGCAATTCGTTTTTTTCAGGAAGCCCTGGCAACC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单胺氧化酶突变体，其特征在于，所述单胺氧化酶突变体为发生了氨基酸突变的单胺氧化酶；所述单胺氧化酶包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述氨基酸突变的类型包括V239I、N240D、H241C、V243M、N333S、D344S、R345P、H394A、I396K、A397M或Q400E中的任意一种或至少两种的组合。2.根据权利要求1所述的单胺氧化酶突变体，其特征在于，所述单胺氧化酶的编码序列包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；优选地，所述单胺氧化酶突变体与单胺氧化酶的同源性在80％以上；优选地，所述单胺氧化酶来源于Pseudogymnoascus。3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的单胺氧化酶突变体。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求3所述的核酸分子。5.一种单胺氧化酶突变体转化子，其特征在于，所述单胺氧化酶突变体转化子为表达权利要求1或2所述的单胺氧化酶突变体的基因工程菌株；优选地，所述单胺氧化酶突变体转化子含有权利要求3所述的核酸分子；优选地，所述单胺氧化酶突变体转化子含有权利要求4所述的表达载体；优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌、毕氏酵母或枯草芽孢杆菌中的任意一种。6.一种权利要求1或2所述的单胺氧化酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：构建表达载体，转化至受体细胞中，构建单胺氧化酶突变体转化子；培养所述单胺氧化酶突变体转化子，收集培养物，得到所述单胺氧化酶突变体。7.一种(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：向含有权利要求1或2所述的单胺氧化酶突变体的溶液中加入6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷，反应，得到所述(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑
烯。8.根据权利要求7所述的(1R,5S)
‑
6,6
‑
二甲基
‑3‑
氮杂双环[3.1.0]己烷
‑2‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，陈剑，徐飞，余长泉，李二军，王苓，
申请(专利权)人：金达威生物技术江苏有限公司江苏诚信药业有限公司，
类型：发明
国别省市：