制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术提出了一种制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的下列氨基酸位点的至少11个具有PEG修饰，T1、K3、K4、K

【技术实现步骤摘要】
84.)。在非人类灵长目动物和其他哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸酶可将溶解性较低的尿酸盐(～11mg/100ml水)转变为更易溶的尿囊素(～147mg/100ml水)，并能由肾更有效的排泄(Wortmann R L，Kelley W N.Kelley
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s textbook of rheumatology(6th).2001：1339-1376)。在欧美，由黄曲霉(Aspergillus flavus)制备的尿酸酶(Uricozyme)在治疗与肿瘤化疗有关的严重高尿酸血症方面的时间已达10年以上(Zittoun R，Dauchy F，Teilaud C，Barthelemy M，Bouchard P.Ann Med Interne.1978.127：479-482.)。由法国Sanofi公司研制的由啤酒酵母发酵生产的重组黄曲霉尿酸酶药物ELITEK已于2002年通过FDA认证并用于由肿瘤化疗引起的严重高尿酸血症的短期治疗(Pui C H，Relling M V，Lascombes F，HarrisonP L，Struxiano A et al.Leukemia.1997.11：1813-1816.)，同时，证明ELITEK的输注还可以减小痛风石的体积(Potaux L，Aparicio M，Maurel C，Ruedas M E，Mart in C L.Nouv PresseMed.1975.4：1109-1112.)。2010年9月FDA批准上市的由美国Savient公司生产的PEG修饰重组猪源尿酸酶(Pegloticase)，用于治疗顽固性痛风，但由于其没有解决免疫原性的问题，导致在临床应用中有约50％病人无效。
[0005]尿酸酶(E C 1.7.3.3)广泛存在于微生物(苛求芽孢杆菌、单假丝酵母、黄曲霉)、植物(大豆、鹰嘴豆)、动物(猪、牛、狗、狒狒)中(Suzuki K，Sakasegawa S，Misaki H，SugiyamaM.J Biosci Bioeng.2004.98：153-158)，在氧气存在的情况下，它能催化尿酸氧化尿囊素并放出二氧化碳(Retailleau P，Colloc
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h，Denis V，Francoise B.Acta Cryst D.2004.60：453-462.)。
[0006]具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右，由301-304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54：229-235.)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg；其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271：517-523.)。另外，来源于豆类植物的尿酸酶，其活性只有2～6IU/mg；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。
[0007]作为人体应用，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40％(Lee C C，Wu X，Gibbs R A，Cook R G，Muzny D M，CaskeyC T.Science.1988.239：1288-1291.)，人体易产生抗尿酸酶抗体，黄曲霉尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。人类尿酸酶基因突变而失去活性，成为假基因。
[0008]因此，基于尿酸氧化酶的治疗高尿酸血症的技术仍需要进一步开发和改进。

技术实现思路

[0009]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0010]活性尿酸氧化酶是同源四聚体蛋白，其中三分之一的氨基酸为强疏水性氨基酸，四聚体蛋白间容易聚集形成八聚体及更大的聚合体。分子量超过100kDa的分子即可有效诱导机体产生免疫反应，而未修饰聚体尿酸氧化酶蛋白的分子量已经达到140kDa，更大分子
量的多聚体尿酸酶将具有更高的免疫原性。人体易产生抗尿酸酶抗体，使其功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。用PEG对蛋白进行共价修饰，已证明可降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期。
[0011]杜克大学(Duke University)和山景公司(Savient)进行了猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶研究(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)。该研究的方法是在保证酶活性不明显减少的情况下，通过分子量为10KDa含甲氧基的聚乙二醇(10KDa-mPEG-NPC)对类猪源尿酸酶赖氨酸残基的ε-氨基进行修饰(所获得的修饰产品为Pegloticase)，初步实现了在人体中用于治疗顽固性痛风的目标。专利技术人发现，上述研究成果并不能彻底解决药物引起的免疫原性问题，临床受试者多次注射后出现了尿酸酶疗效消失的现象，专利技术人推测这可能与Pegloticase蛋白分子量过大有关(Pegloticase分子量为540kDa)，同时由于pegloticase不适于注射，适于静脉推注，降低了受试者长期使用的依从性，进而严重限制了其临床应用。到目前为止，还没有免疫原性更低的以及可以采用皮下注射的长效尿酸氧化酶药物。
[0012]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0013]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法。根据本专利技术的实施例，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的下列氨基酸位点的至少11个具有PEG修饰，T1、K3、K4、K
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，所述方法包括：将尿酸氧化酶和聚乙二醇进行偶联反应，其中，所述聚乙二醇是以酸性溶液的形式提供的，所述尿酸氧化酶和聚乙二醇的摩尔比为1：(56～94)，以便获得聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。根据本专利技术实施例的方法所制备的聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，其修饰位点T1、K3、K4、K
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法，其特征在于，将尿酸氧化酶和聚乙二醇进行偶联反应，其中，所述聚乙二醇是以酸性溶液的形式提供的，所述尿酸氧化酶和聚乙二醇的摩尔比为1：(56～94)，以便获得聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液为含有至少一种选自有机酸和/或无机酸的酸性溶液，任选地，所述有机酸选自：乙酸，草酸，马来酸，酒石酸，柠檬酸，琥珀酸，丙二酸，己二酸，抗坏血酸，苯磺酸，苯甲酸，丁酸，环戊基丙酸，二葡萄糖酸，十二烷基硫酸，乙磺酸，甲酸，反丁烯二酸，葡庚糖酸，甘油磷酸，葡萄糖酸，庚酸，己酸，2-羟基-乙磺酸，乳糖醛酸，乳酸，月桂酸，月桂基硫酸，苹果酸，丙二酸，甲磺酸，2-萘磺酸，烟酸，油酸，棕榈酸，果胶酸，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸，丙酸，硬脂酸，对甲苯磺酸，十一酸，戊酸；所述无机酸选自：盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，高氯酸，氢碘酸、硝酸、过硫酸、硼酸、重铬酸、硅酸、铬酸、硫氰酸。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液中氢离子的浓度为1～5mmol/L。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酸性溶液含有盐酸或硫酸或冰醋酸。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸在酸性溶液中的浓度为1～5mmol/L。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿酸氧化酶和聚乙二醇的摩尔比为1：(45～110)，优选地，所述尿酸氧化酶和聚乙二醇的摩尔比为1：(56～94)。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇在所述酸性溶液中的浓度为100～300mmol/L。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇分子量不超过6KD。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇具有单甲氧基或羟基；任选地，所述聚乙二醇为直链或支链结构；任选地，所述聚乙二醇与尿酸氧化酶通过酰胺键偶联；优选地，所述聚乙二醇为修饰性聚乙二醇，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团选自下列的至少一种：N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺丁酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯和对硝基苯碳酸酯；优选地，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团为N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联反应是在碳酸盐缓冲溶液中进行的；优选地，所述碳酸盐缓冲溶液的pH为9～11。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿酸氧化酶在偶联反应体系中的浓度为10mg/ml。12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶联反应是在5～30℃的条件下进行至少60分钟。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿酸氧化酶中的下列氨基酸位点的至少11个具有PEG修饰，T1、K3、K4、K
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。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述氨基酸位点定位是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列定位的；优选地，所述尿酸氧化酶具有SEQ ID NO:1～7所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1～7相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的多肽；或与SEQ ID NO:1～7相比具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的多肽；优选地，所述尿酸氧化酶具有SEQ ID NO:1～4所示的氨基酸序列。15.根据权利要求1～14任一项所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶在下列4个氨基酸位点的至少之一具有PEG修饰，K
30
、K
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、K
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和K
231
；任选地，所述氨基酸位点定位是以SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘日勇，王志明，何云凤，王彧，付志成，闫天文，胡春兰，苏国威，谭长城，丁旭朋，杨辉，王宏英，丁琼，汪倩，文海燕，范开，
申请(专利权)人：杭州远大生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：