尿酸氧化酶制剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种尿酸氧化酶制剂，该尿酸氧化酶制剂包括：活性成分，所述活性成分选自聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶，以及辅料，所述辅料选自缓冲试剂。该尿酸氧化酶制剂用于治疗或预防高尿酸及其相关疾病，且制备方法简单，生产效率高，原料廉价易得，稳定性高。稳定性高。

【技术实现步骤摘要】
尿酸氧化酶制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地，涉及尿酸氧化酶制剂、药物组合物。

技术介绍

[0002]痛风是长期嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所引起的疾病，其临床特点为高尿酸血症，并因尿酸盐溶解性较差，结晶沉淀累积在皮下、关节、肾脏形成痛风石，导致反复发作的急性关节炎，并累及肾脏引起尿酸性尿路结石和间质性肾炎。人体内嘌呤经酶作用转化终产物尿酸，正常情况下，男性血液中尿酸含量149～416mmol/L,女性血液中尿酸含量89～357mol/L，体内尿酸量约1200mg，生成与排泄量约600mg/天，处于平衡状态。但机体摄入尿酸过多或排泄机制出现障碍，造成尿酸在血液中累积达到70mg/L以上，则会引起高尿酸血症。尿酸钠在血液或滑膜液中达到饱和状态结晶析出，或长时间高尿酸血症在关节、软组织周围结晶沉淀，可导致痛风性急性关节炎或痛风性慢性关节炎以及关节畸形。尿酸盐在肾小管、肾间质内的沉积引发炎症可导致慢性尿酸盐肾病；严重的高尿酸血症患者(如白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤患者)，短期内大量尿酸沉积造成尿路阻塞引发急性肾功能衰竭，又称尿酸肾病。
[0003]高尿酸血症的成因，与人在进化过程中尿酸酶基因的突变失活有关，因此人类不能自身合成具有活性的尿酸酶。目前治疗高尿酸血症的方法之一是使用尿酸酶降低患者体内的尿酸含量。
[0004]尿酸氧化酶(E C 1.7.3.3)广泛存在于微生物(苛求芽孢杆菌、单假丝酵母、黄曲霉)、植物(大豆、鹰嘴豆)、动物(猪、牛、狗、狒狒)中(Suzuki K，Sakasegawa S，Misaki H，SugiyamaM.JBiosci Bioeng.2004.98：153
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158)，在氧气存在的情况下，它能催化尿酸氧化尿囊素并放出二氧化碳(Retailleau P，Colloc
’
h，Denis V，Francoise B.ActaCryst D.2004.60：453
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462.)。具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右，由301
‑
304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54：229
‑
235.)。
[0005]具有活性的尿酸酶是一四聚体蛋白，由相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右，由301
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304个氨基酸组成。每个溶液中尿酸酶的酶活力最高的pH值为8.0(Bayol A etal.Biophys Chem.1995.54：229
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235.)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，活性最高的来源于黄曲霉，达到27IU/mg；其次是来源于苛求芽胞杆菌，它的活性保持在13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271：517
‑
523.)。另外，来源于豆类植物的尿酸酶，其活性只有2～6IU/mg；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达以后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。
[0006]作为人体应用，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用的重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40％(Lee C C，Wu X，Gibbs R A，Cook R G，Muzny D M，
CaskeyC T.Science.1988.239：1288
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1291.)，人体易产生抗尿酸酶抗体，黄曲霉尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。
[0007]尿酸氧化酶作为一种蛋白质，在制备成药物制剂时需保证其酶活、稳定性及存放时间，而不同的制备方法、剂型、缓冲剂、稳定剂等均会影响尿酸氧化酶的存放时间及活性，同时，在蛋白结构上进行化学修饰也会影响尿酸氧化酶制剂的稳定性。
[0008]因此，研发一种能够稳定存放，保证尿酸氧化酶活性的尿酸氧化酶制剂很有必要。

技术实现思路

[0009]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0010]活性尿酸氧化酶是同源四聚体蛋白，其中三分之一的氨基酸为强疏水性氨基酸，四聚体蛋白间容易聚集形成八聚体及更大的聚合体。分子量超过100kDa的分子即可有效诱导机体产生免疫反应，而未修饰聚体尿酸氧化酶蛋白的分子量已经达到140kDa，更大分子量的多聚体尿酸酶将具有更高的免疫原性。人体易产生抗尿酸酶抗体，使其功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。用PEG(聚乙二醇)对蛋白进行共价修饰，已证明可降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期。
[0011]杜克大学(Duke University)和山景公司(Savient)进行了猪来源和狒狒来源嵌合尿酸酶研究(Michael H，Susan J.K.2006.US7056713B1)。该研究的方法是在保证酶活性不明显减少的情况下，通过分子量为10KDa含甲氧基的聚乙二醇(10KDa
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mPEG
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NPC)对类猪源尿酸酶赖氨酸残基的ε
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氨基进行修饰(所获得的修饰产品为Pegloticase)，初步实现了在人体中用于治疗顽固性痛风的目标。专利技术人发现，上述研究成果并不能彻底解决药物引起的免疫原性问题，临床受试者多次注射后出现了尿酸酶疗效消失的现象，专利技术人推测这可能与Pegloticase蛋白分子量过大有关(采用10kd的PEG，导致Pegloticase分子量为540kDa)，同时由于pegloticase不适于注射，适于静脉推注，降低了受试者长期使用的依从性，进而严重限制了其临床应用。到目前为止，还没有免疫原性更低的以及可以采用皮下注射的长效尿酸氧化酶药物。
[0012]使用聚乙二醇对尿酸氧化酶进行修饰，依据修饰数量及修饰位点的不同，会改变尿酸氧化酶的性质，进而尿酸氧化酶制剂的配方需要改变，以保证不同尿酸氧化酶在制剂中的酶活、稳定性及保存时间符合标准。
[0013]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0014]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种尿酸氧化酶制剂。根据本专利技术的实施例，所述尿酸氧化酶制剂包括：活性成分，所述活性成分选自聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶；以及辅料，所述辅料选自缓冲试剂，其中所述缓冲试剂包括下列至少之一：磷酸盐、盐酸盐和碳酸盐。根据本专利技术实施例的制剂的处方构成简单，尿酸氧化酶在制剂处方下稳定性较高，该制剂的制备能够节约生产成本，生产效率高。
[0015]另外，根据本专利技术上述实施例的尿酸氧化酶制剂，还具有如下附加的技术特征：
[0016]根据本专利技术的实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿酸氧化酶制剂，其特征在于，包括：活性成分，所述活性成分选自聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶；以及辅料，所述辅料选自缓冲试剂，其中所述缓冲试剂包括下列至少之一：磷酸盐和盐酸盐。2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶制剂，其特征在于，所述尿酸氧化酶中的下列氨基酸位点中的至少11个具有PEG修饰：T1、K3、K4、K
30
、K
35
、K
76
、K
79
、K
97
、K
112
、K
116
、K
120
、K
152
、K
179
、K
222
、K
231
、K
266
、K
272
、K
285
、K
291
和K
293
，所述氨基酸位点定位是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列定位的。3.根据权利要求2所述的尿酸氧化酶制剂，所述尿酸氧化酶中的下列4个氨基酸位点中的至少1个、至少两个、至少三个或四个具有PEG修饰：K
30
、K
35
、K
222
和K
231
。4.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶制剂，其特征在于，所述聚乙二醇具有单甲氧基或羟基；任选地，所述聚乙二醇为直链或支链结构；任选地，所述聚乙二醇与尿酸氧化酶通过酰胺键偶联；优选地，所述聚乙二醇为修饰性聚乙二醇，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团选自下列的至少一种：N羟基琥珀酰亚胺、N羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、N羟基琥珀酰亚胺乙酸酯、N羟基琥珀酰亚胺丙酸酯、N羟基琥珀酰亚胺丁酸酯、N羟基琥珀酰亚胺琥珀酸酯和对硝基苯碳酸酯；优选地，所述修饰性聚乙二醇的修饰基团为N羟基琥...

【专利技术属性】
技术研发人员：何云凤，王志明，付志成，王彧，文海燕，闫天文，胡春兰，苏国威，刘日勇，丁旭朋，范开，王宏英，汪倩，
申请(专利权)人：杭州远大生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：