一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基、计数方法及培养基的筛选方法技术

本发明专利技术属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基、计数方法及培养基的筛选方法。嗜酸乳杆菌计数用培养基中含有0.1μg/mL~0.125μg/mL的四环素，婴儿双歧杆菌计数用培养基中含有3μg/mL~5μg/mL的四环素，四联活菌制品由蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌制成。本发明专利技术为基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基的筛选方法，确定具有代谢差异的抗生素种类，并进一步进行浓度筛选，有效消除粪肠球菌对嗜酸乳杆菌活菌计数的干扰，有效消除嗜酸乳杆菌和粪肠球菌对婴儿双歧杆菌活菌计数的干扰，保证计数结果准确有效。效。效。

【技术实现步骤摘要】
一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基、计数方法及培养基的筛选方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基
、
计数方法及培养基的筛选方法
。

技术介绍

[0002]双歧杆菌四联活菌片的主要成分是蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌，用于治疗与肠道菌群失调相关的腹泻
、
便秘
、
功能性消化不良
。
本品每片中婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌分别应不低于
0.5
×
108CFU
；粪肠球菌应不低于
0.5
×
107CFU
；蜡样芽孢杆菌应不低于
0.5
×
106CFU。
准确计数产品中的活菌数，是重要的产品质量控制内容
。
现行的活菌计数方法是根据活菌的种属不同，营养需求有差异，建立选择性的培养条件，针对性的培养某一种活菌并进行计数
。
但是，本品为四联活菌制品，很难针对每一种活菌，建立有效的选择性培养条件，同时能排除其他活菌的干扰
。
现行标准中收载的检测方法，其主要问题在于：在进行嗜酸乳杆菌计数时，粪肠球菌在该培养条件下也会迅速生长，与嗜酸乳杆菌菌落混合，严重干扰计数；在进行婴儿双歧杆菌计数时，嗜酸乳杆菌和粪肠球菌均为兼性厌氧菌，也可在该培养条件下生长，三种菌落混合，无法计数婴儿双歧杆菌菌落数
。
目前尚无有效的培养基，用于嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌的计数培养
。
筛选出可以有效抑制干扰微生物的培养基或培养基添加剂，是解决问题的关键
。
[0003]现有基于药敏试验的筛查方法，多是在标准或试剂给定的有限的抗生素抗性谱上进行分析，其中可用于分析的抗生素数量少，且工作量巨大，步骤繁杂，效果差，这种基于有限研究抗生素的盲筛药敏试验结果不具有前瞻性和预测性
。
[0004]基因组规模代谢网络模型（
Genome
‑
scale Metabolic Network Model
，
GEM
）是基于基因
‑
蛋白
‑
反应（
Gene
‑
Protein
‑
Reaction
，
GPR
）三者关联，模拟细胞内复杂代谢通路的一种数学模型，可以预测细胞内的代谢通路和通量分布
。
目前，基于基因组测序注释和生化数据库已建立了许多微生物及动植物细胞的
GEM
，其已经成为系统研究生物体内代谢的主要建模分析方法之一
。
根据
GPR
关联数据，利用数学模型，
GEM
系统描述了生物体内一整套基于化学计量学的质量平衡代谢反应，可以通过通量平衡分析（
Flux Balance Analysis
，
FBA
）
、
通量可变性分析（
Flux Variability Analysis
，
FVA
）及代谢调节最小化分析（
Minimization of Metabolic Adjustment
，
MOMA
）等方法预测代谢反应的通量值
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中没有有效的培养基用于嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌的计数培养的问题，本专利技术提供了一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基
、
计数方法及培养基的筛选方法，筛选适宜种类和浓度的抗生素加入培养基中，可有效抑制干扰活菌的生长，保证计数结果准确有效
。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基，嗜酸乳杆菌计数用培养基中含有
0.1
μ
g/mL~0.125
μ
g/mL
的四环素，婴儿双歧杆菌计数用培养基中含有3μ
g/mL~5
μ
g/ml
的四环素；所述四联活菌制品由蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌制成
。
[0007]进一步地，所述的嗜酸乳杆菌计数用培养基中含有
0.125
μ
g/mL
的四环素，婴儿双歧杆菌计数用培养基中含有3μ
g/mL
的四环素
,
进一步地，分别用嗜酸乳杆菌计数用培养基和婴儿双歧杆菌计数用培养基对四联活菌制品进行培养，对嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行计数
。
[0008]本专利技术中，公开了基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基的筛选方法，采用代谢通路分析的方法进行计数用培养基的筛选，具体包括以下步骤：（1）基因组提取：分别培养
、
纯化蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌，提取完整基因组；（2）基因组序列拼接及序列校正：将基因组测序的得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；（3）基因注释及酶功能注释；（4）抗生素抗性基因筛选及分析：经过注释的基因组与
CARD
数据库进行比对，采用
DIAMOND
检索策略，检索收集蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌中含有的抗生素抗性基因；（5）关键代谢通路筛选及分析：检索与抗生素抗性基因相关的代谢通路，并对抗生素抗性基因进行代谢通路归类；（6）目标抗生素确认：根据筛选获得的抗生素抗性基因和代谢通路分析，选择四联活菌制品中四种菌株共有的抗性基因及代谢通路，根据代谢通路进行培养基成分的优化，筛选出对四种菌存在不同耐药性的抗生素作为培养基添加剂；（7）抗生素浓度分析：步骤（6）筛选出的抗生素添加剂分别加入至嗜酸乳杆菌培养基和婴儿双歧杆菌培养基中，筛选出计数用培养基中抗生素的浓度
。
[0009]进一步地，步骤（1）采用磁珠法提取完整基因组
。
[0010]进一步地，步骤（2）中以二代及三代测序结果互为参考，采用从头测序方法，原始数据通过
FastQC
进行质量评估，通过
Trimmomatic
对测序数据进行质量剪切，使用
SPAdes
拼接二代测序数据，采用
GapFiller
对拼接得到的
contig
补
GAP
，利用
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基，其特征在于，嗜酸乳杆菌计数用培养基中含有
0.1
μ
g/mL~0.125
μ
g/mL
的四环素，婴儿双歧杆菌计数用培养基中含有3μ
g/mL~5
μ
g/mL
的四环素；所述四联活菌制品由蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌制成
。2.
根据权利要求1所述的基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基，其特征在于，所述的嗜酸乳杆菌计数用培养基中含有
0.125
μ
g/mL
的四环素，婴儿双歧杆菌计数用培养基中含有3μ
g/mL
的四环素
。3.
一种利用权利要求1或2所述的基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基进行活菌计数的方法，其特征在于，分别用嗜酸乳杆菌计数用培养基和婴儿双歧杆菌计数用培养基对四联活菌制品进行培养，对嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行计数
。4.
一种权利要求1或2所述的基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基的筛选方法，其特征在于，采用代谢通路分析的方法进行计数用培养基的筛选，具体包括以下步骤：（1）基因组提取：分别培养
、
纯化蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌，提取完整基因组；（2）基因组序列拼接及序列校正：将基因组测序得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；（3）基因注释及酶功能注释；（4）抗生素抗性基因筛选及分析：经过注释的基因组与
CARD
数据库进行比对，采用
DIAMOND
检索策略，检索收集蜡样芽胞杆菌
、
粪肠球菌
、
嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌中含有的抗生素抗性基因；（5）关键代谢通路筛选及分析：检索与抗生素抗性基因相关的代谢通路，并对抗生素抗性基因进行代谢通路归类；（6）目标抗生素确认：根据筛选获得的抗生素抗性基因和代谢通路分析，选择四联活菌制品中四种菌株共有的抗性基因及代谢通路，根据代谢通路进行培养基成分的优化，筛选出对四种菌存在不同耐药性的抗生素作为培养基添加剂；（7）抗生素浓度分析：步骤（6）筛选出的抗生素添加剂分别加入至嗜酸乳杆菌培养基和婴儿双歧杆菌培养基中，筛选出计数用培养基中抗生素的浓度
。5.
根据权利要求4所述的基于代谢通路分析的四联活菌制品活菌计数用培养基的筛选方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁勃，邢晟，王宏英，沈振，任丽宏，孟晓丽，李颖，
申请(专利权)人：杭州远大生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：