本发明专利技术涉及一种应用在水果保鲜领域中的枯草芽孢杆菌，及以此为活性物质的菌剂，本发明专利技术涉及的枯草芽孢杆菌命名为Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｓｔｉｌｉｓ?Ｊ１８，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ：３６６５，菌株经过发酵培养后，制成发酵剂，发酵剂分别与氯化钙和壳聚糖溶液混合制成干粉剂和被膜剂，其对梨采后黑斑病同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等都有显著的防治效果，枯草芽孢杆菌Ｊ１８是一株对水果和农作物病害有广谱抗性的拮抗菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种对采后水果的病菌有抑制作用的具有广谱抗病原真菌活性的枯 草芽孢杆菌，及以所述枯草芽孢杆菌为活性菌的菌剂及其制备方法，及菌剂在水果保鲜领 域的应用。
技术介绍
我国水果采后腐烂损失严重，造成了巨大经济损失，采后病原微生物的侵染是造 成采后腐烂损失的最主要原因，在水果保鲜领域，大量使用化学杀菌剂以防止水果腐败，但 是在水果保鲜中大量使用化学杀菌剂给水果的食用安全造成了很大的影响，如何减少水果 保鲜中化学杀菌剂的使用成为公众十分关注的食品安全问题。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是自然界中广泛的一种非致病细菌，在土壤、 植物根际和植物体内存在有大量的枯草芽孢杆菌，据文献报道，这些菌株会对植物病原菌 起到抑制作用，或是诱导植物产生抗性，有一些菌株对植物还有促生作用，就是常报道的 PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)。由于其具有广谱抗菌活性、极强的抗逆 能力、存活时间长、而且对人畜无毒害作用等优点，这就有利于制剂的加工，而且大规模生 产工艺简单，成本较低，运输也方便，因此，枯草芽孢杆菌越来越多的被引入植病生防领域， 是目前一种较为理想的具有生防功能的微生物。国内研究现状河南农科院植保所孔建等从果园中分离到的枯草芽孢杆菌B-903对多种果蔬上 的病菌有抑制作用，如番茄早疫病菌、苹果轮纹病菌等。用于植病生防研究的枯草芽孢杆菌 还包括防治苹果和梨采后青霉病的枯草芽孢杆菌H110，防治西瓜枯萎病菌的Bn，防治桃和 油桃褐腐病的菌株B-912，防治苹果霉心病的BL03和XM16等。国外研究现状美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂 Sernade，并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，QST713叶面施用能防治蔬菜、樱桃、 葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌病害。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对采后水果的病原菌有抑制作用的具有广谱抗病原真 菌活性的枯草芽孢杆菌，以及以所述枯草芽孢杆菌为活性菌的菌剂，及菌剂的应用。本专利技术是采用如下技术方案实现的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌 Bacillus substilis J18，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No :3665。一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的发酵液，其是由如 下步骤制成(1)制备活化的菌液； (2)种子培养；(3)发酵培养将所述种子培养得到的种子培养液按照接种量为 3%加入到 发酵培养基中，发酵温度为25°C 30°C，通气量为0. 3 0. 6m3/h，pH值为6. 8 7. 2，流加 食用豆油消泡，不流加调节PH值的酸碱性物质。流加培养基葡萄糖15g，酵母膏10g，食用豆油50mL，水IOOOmL制成混合液灭菌 后一起流加；流加时间发酵8h开始流加；发酵周期34士2h，得发酵液。在发酵液中加入防腐剂、表面活性剂、紫外防护剂。每升发酵液中加入防腐剂为凯松2g，表面活性剂为吐温-20 10g，紫外防护剂为 山梨醇5g。一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的干粉剂，其制备方 法是，将发酵液离心后去上清液得湿菌体，湿菌体与等重量的氯化钙混合均勻，烘干至粉末 状，得到干粉菌剂。一种以枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18为活性菌制成的被膜剂，其制备方 法是，将发酵液离心后去上清液得湿菌体，与壳聚糖溶液复配制成被膜剂。枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18在水果保鲜领域中的应用。我们从梨果表面，梨树叶片以及梨果园土壤中分离到一株对梨采后病原菌一黑斑 病有显著拮抗效果的一株细菌，我们把它命名为J18。枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18具有以下性质在LB培养基上培养，J18菌落乳白色，无光泽，近圆形，边缘不整齐，菌落隆起，表 面粗糙有褶皱。经过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和伴孢晶体染色，结果表明菌株J18 为革兰氏染色阳性芽孢杆菌，芽孢中生，鞭毛周生，没有伴孢晶体形成。J18的菌体大小为 0. 6X2. 7μπι。菌株J18的生理生化鉴定结果显示其为好氧生长；接触酶、明胶水解、淀粉水解、 硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、葡萄糖产酸和甘露醇产酸等反应阳性；喷哚试验、甲基红反应、 H2S产生试验、酪氨酸水解等反应为阴性；最高生长温度55°C，能在10% NaCl及pH5. 7条 件下生长，以上特征符合《常见细菌系统鉴定手册》中关于枯草芽孢杆菌的描述。经过进一步的分子生物学鉴定，J18的16S rDNA与GenBank数据库中的序列进行 同源性比较，发现其与枯草芽孢杆菌有99%的同源性。利用DNAMAN将测序结果与同源性 相近的菌株进行多重序列比较，并做进化树分析，进一步确定其分类地位。根据细菌分类标 准，结合菌株J18形态特征、生理生化特征，将菌株J18鉴定为枯草芽孢杆菌。氯化钙和具有良好的自发成膜性的壳聚糖处理采后水果不仅能保持梨果较高的 硬度和V。含量，降低梨果的呼吸强度和失水率，减少果实的底物消耗，，有效地抑制了果实 的衰老，提高梨的贮藏品质。同时能高效抑制病原微生物的繁殖和生长，降低果实病害的发 生。因此采用氯化钙和壳聚糖与拮抗菌J18发酵液复配的方式使用。本专利技术的有益效果是，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J18的发酵剂、干粉剂、 被膜剂对梨采后黑斑病有显著的防治效果，同时对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病等都有显著的防治效果，因此，枯草芽孢杆 菌J18是一株对水果和农作物病害有广谱抗性的拮抗菌。具体实施例方式实施例1一种枯草芽孢杆菌，其特征在于其命名为枯草芽孢杆菌Bacillus substilisJIS, 在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为CGMCC No :36650J18微生物发酵液的生产方法(1)种子活化将枯草芽孢杆菌Bacillus substilis J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30°C、150 250r/min培养18h。取培养好的菌悬液稀释，均勻涂 布到LB固体平板培养基中，25°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培 养基试管中，300C、150 250r/min培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB 液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150 250r/min。所述LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水1000mL。(2)种子培养将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150 250r/min，30°C摇 床培养16h。(3)发酵培养使用20L发酵罐进行分批发酵。装料系数0.6，接种量为1%，发 酵温度30°C，通气量0. 3m3/h，搅拌转速150 250r/min，溶氧(DO)保持在75%，pH值为 6. 8 7. 2，流加食用豆油以消除气泡，不流加调节pH值的酸碱性物质。发酵培养基配方为葡萄糖10g，蔗糖30g，蛋白胨本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌，其特征在于其命名为枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓＪ１８，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ：３６６５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋水山，关军锋，宋聪，张霞，马宏，邱健，黄媛媛，赵芊，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，河北省农林科学院遗传生理研究所，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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