【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术辅助育种，特别是涉及用于鉴定黄瓜对细菌性茎软腐病抗性的snp分子标记及其应用。
技术介绍
1、黄瓜是我国的重要蔬菜作物，尤其在设施生产中占有举足轻重的地位，也是性别决定分化和维管生物学研究的模式植物(li et al.,2019)。但在黄瓜栽培生产过程中，容易受到多种病害的侵染，以往的非流行性细菌病害茎软腐病近年来也逐渐成为黄瓜的新兴流行病害，会导致产量降低20％-30％，品质下降，严重影响植株生长。胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种(pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense，简称pcb)引起的黄瓜细菌性茎软腐病(bacterial stem soft rot,简称bssr)在2017年被首次报道(冯志琴,2017)。目前，黄瓜生产上对茎软腐病的防控方法，以防治为主。在生产上，虽然可以通过种子消毒、嫁接、轮作等物理和生化方法防治，但它们均不能从根本上解决对黄瓜生产的危害。选育和推广抗茎软腐病的黄瓜品种，才是防治该病害最经济有效的方法，也是黄瓜绿色高效生产的重要保障。选育和推广抗细菌性茎软腐病的黄瓜品种，是防治该病害最经济有效的方法，也是黄瓜绿色高效生产的重要保障。研究黄瓜细菌性茎软腐病抗性遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。
2、遗传学研究表明，植物对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(简称pcc)的抗性是由多基因控制的数量性状(yamagishi h,1990)。对马铃薯进行qtl分析，发现马铃薯对pca抗性遗传控制非常复杂，至少有1
3、酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence，caps)标记是利用特异引物pcr与限制性酶切相结合而产生的一种检测snp位点的dna标记。其原理是snp突变位点位于某种内切酶的识别序列上，经过特异引物pcr扩增后，用相应内切酶对pcr产物进行酶切，从而产生酶切片段的多态性，通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色即可显示。但是snp恰好位于某种限制性酶切位点的情况还比较少，michaels和amasino(1998)及neff(1998)在caps标记基础上，开发了人工引入错配碱基的衍生酶切扩增多态性标记(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dcaps)，从而几乎能够将所有snp位点转换成可以电泳检测的标记。caps和dcaps均具有共显性、位点特异性、操作简单、检测快速、成本低且不依赖于精密仪器设备等特点，可用于用于植物基因分型、定位、遗传多样性分析、品种鉴定等方面。
4、到目前为止，与抗黄瓜细菌性茎软腐病基因bssr紧密连锁的snp标记尚未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是针对上述问题，提供一种用于鉴定黄瓜对细菌性茎软腐病抗性的snp分子标记，所述snp标记的位点为黄瓜6号染色体物理位置第10,867,465bp处，该位点的碱基是a或g，该位点碱基为a的黄瓜材料为抗细菌性茎软腐病黄瓜材料，该位点碱基为g的黄瓜材料为感细菌性茎软腐病黄瓜材料。
2、所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示,其中第27位碱基是a或g。
3、本专利技术的再一目的是提供一种用于检测上述的snp分子标记的特异性引物对，包括引物bssr-snp-01-f、bssr-snp-01-r，所述引物的核酸序列如下：
4、bssr-snp-01-f：5'-acctttataaaaatattgtgtactta-3'，
5、bssr-snp-01-r：5'-gagtttcatcatctaccatc-3'。
6、本专利技术的再一目的是提供一种用于检测上述的snp分子标记的试剂盒，包含上述的特异性引物对。
7、所述的试剂盒还包含黄瓜基因组dna提取试剂、pcr扩增反应试剂、pcr扩增产物测序试剂或者snp差异位点识别试剂；优选所述snp差异位点识别试剂包括能够识别snp差异位点的限制性内切酶，优选还包括聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；优选所述限制性内切酶为ddei。
8、本专利技术的再最后目的是提供上述的snp分子标记在如下(1)-(5)任一中的应用：
9、(1)鉴定或辅助鉴定黄瓜抗/感细菌性茎软腐病材料；
10、(2)鉴定或辅助鉴定黄瓜抗/感细菌性茎软腐病基因bssr基因；
11、(3)筛选或者辅助筛选抗细菌性茎软腐病黄瓜品种；
12、(4)培育或者辅助培育抗细菌性茎软腐病黄瓜品种；
13、(5)黄瓜育种。
14、在上述应用的技术方案中，所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组dna作为模板，采用上述的snp分子标记的扩增引物进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行测序或酶切电泳检测，所述酶切电泳检测指采用能够识别所述snp分子标记差异位点的限制性内切酶对pcr扩增产物进行酶切，然后对扩增产物进行电泳，优选所述电泳采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
15、在上述应用的技术方案中，所述snp分子标记的扩增引物如下：
16、bssr-snp-01-f：5'-acctttataaaaatattgtgtactta-3'，
17、bssr-snp-01-r：5'-gagtttcatcatctaccatc-3'；
18、pcr扩增获得235bp片段，当采用测序检测时，pcr扩增片段的第27位碱基为a的黄瓜材料为抗细菌性茎软腐病黄瓜材料；pcr扩增片段的第27位碱基为g的黄瓜材料为感细菌性茎软腐病黄瓜材料；pcr扩增片段的第27位碱基同时存在a或g的黄瓜材料为杂合抗细菌性茎软腐病材料；
19、当采用酶切电泳检测时，所述限制性内切酶为ddei，如果酶切后电泳得到212bp的条带，则检测对象为感细菌性茎软腐病材料；如果酶切后电泳得到235bp的条带，则检测对象为抗细菌性茎软腐病材料；如果酶切同时得到212bp和235bp的条带，则检测对象为杂合抗细菌性茎软腐病材料。
20、在上述应用的技术方案中，
21、pcr扩增的反应体系包括dna模板、扩增引物、2×3g taq master mix for page、双蒸水；
22、ddei酶切的体系为：pcr产物3μl，内切酶0.2μl，neb cutsmart buffer 1μl，双蒸水5.8μl。
23、所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴定黄瓜对细菌性茎软腐病抗性的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP标记的位点为黄瓜6号染色体物理位置第10,867,465bp处，该位点的碱基是A或G，该位点碱基为A的黄瓜材料为抗细菌性茎软腐病黄瓜材料，该位点碱基为G的黄瓜材料为感细菌性茎软腐病黄瓜材料。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,其中第27位碱基是A或G。
3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的特异性引物对，其特征在于，包括引物BSSR-SNP-01-F、BSSR-SNP-01-R，所述引物的核酸序列如下：
4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于：包含权利要求3所述的特异性引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包含黄瓜基因组DNA提取试剂、PCR扩增反应试剂、PCR扩增产物测序试剂或者SNP差异位点识别试剂；优选所述SNP差异位点识别试剂包括能够识别SNP差异位点的限制性内切酶，优选还包括聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂；优选所述限
6.权利要求1或2所述的SNP分子标记在如下(1)-(5)任一中的应用：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的SNP分子标记的扩增引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序或酶切电泳检测，所述酶切电泳检测指采用能够识别所述SNP分子标记差异位点的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，然后对扩增产物进行电泳，优选所述电泳采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述SNP分子标记的扩增引物如下：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
...【技术特征摘要】
1.用于鉴定黄瓜对细菌性茎软腐病抗性的snp分子标记，其特征在于：所述snp标记的位点为黄瓜6号染色体物理位置第10,867,465bp处，该位点的碱基是a或g，该位点碱基为a的黄瓜材料为抗细菌性茎软腐病黄瓜材料，该位点碱基为g的黄瓜材料为感细菌性茎软腐病黄瓜材料。
2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示,其中第27位碱基是a或g。
3.一种用于检测权利要求1或2所述的snp分子标记的特异性引物对，其特征在于，包括引物bssr-snp-01-f、bssr-snp-01-r，所述引物的核酸序列如下：
4.一种用于检测权利要求1或2所述的snp分子标记的试剂盒，其特征在于：包含权利要求3所述的特异性引物对。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包含黄瓜基因组dna提取试剂、pcr扩增反应试剂、pcr扩增产物测...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗晗，张圣平，董邵云，张倚，刘小萍，官健涛，顾兴芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。