本发明专利技术涉及拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法。该茯砖茶多糖是从湖南安化茯砖茶中分离纯化得到，其中性糖含量为48.63％，糖醛酸含量为52.14％，是一种由摩尔比为55.2∶16.5∶10.2∶8.9∶6.6∶2.5的半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖组成的分子量为20.5kDa的杂多糖。茯砖茶多糖被人体摄入之后，不会在上消化道中被降解，而是在结肠中被肠道微生物降解利用，而其中拟杆菌为复杂聚糖的主要降解者，本实验旨在分离纯化得到可以降解茯砖茶多糖的拟杆菌菌种并利用拟杆菌降解茯砖茶多糖，制备多糖降解产物。本实验利用茯砖茶多糖为唯一碳源，进行体外发酵，并利用类杆菌‑胆汁‑七叶苷(BBE)琼脂培养基筛选得到四株拟杆菌：卵形拟杆菌、单形拟杆菌、脆弱拟杆菌、多形拟杆菌，四株拟杆菌均可以降解利用茯砖茶多糖，可以为制备茯砖茶多糖益生元提供思路，本发明专利技术在保健食品行业具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然植物多糖与肠道微生物领域，具体涉及拟杆菌的分离与拟杆菌降解茯砖茶多糖中的应用。
技术介绍
1、茯砖茶是以黑毛茶为原料，经两步发酵而成的黑毛茶，茯砖茶的风味独特。茯砖茶中含有很多生物活性物质，具有抗氧化、抗肥胖、抗肿瘤、免疫调节、降血脂等功能，其中茯砖茶多糖是重要的生物活性成分，茯砖茶多糖可以改善高脂饮食造成的代谢紊乱，并且起到调节肠道菌群的作用。茯砖茶多糖不能在上消化道中被降解，其主要发挥作用的途径是被结肠中的微生物分解代谢，其中拟杆菌属拥有大量的碳水化合物酶编码基因，拟杆菌约有20％左右的基因与复杂碳水化合物的降解有关，茯砖茶多糖可以促进拟杆菌属的增殖，因此用茯砖茶多糖做为唯一碳源进行体外发酵来富集拟杆菌，并进一步用选择培养基来筛选拟杆菌是一种可行的手段。多糖分子量的大小与活性有关，低分子量的多糖活性常常优于高分子量多糖，因此利用所筛选的拟杆菌降解茯砖茶多糖，得到分子量较小的降解产物具有一定实际意义，并且为茯砖茶多糖制备益生元提供一定理论基础。
技术实现思路
1、本专利技术旨在将利用茯砖茶多糖富集拟杆菌，利用选择培养基进行拟杆菌的筛选，并利用拟杆菌降解茯砖茶多糖，得到降解产物，为利用茯砖茶多糖制备益生元提供理论依据。
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、茯砖茶多糖的制备，步骤如下：
4、(1)将湖南安化茯砖茶粉碎，加入到95％乙醇(v/v)中并在70℃条件下水浴8h，纱布过滤弃去上清，收集茯砖茶残渣，共处理3次.
5、(2)将步骤(1)中茯砖茶残渣干燥至恒重后，按料液比1∶10(w/v)、提取温度70℃、提取时间3h条件下提取3次，合并提取液并浓缩至合适的体积；
6、(3)将步骤(2)中浓缩液与4倍体积无水乙醇混合，4℃条件下放置过夜。离心(4000rpm、15min)取沉淀并复溶于纯水中，利用sevage法反复萃取5次去除蛋白，保留水相萃取液。
7、(4)将步骤(3)中所得溶液于45℃条件下减压浓缩至合适体积，并用8000-14000da透析袋透析3天，而后将透析袋内液浓缩至合适体积，真空冷冻干燥2天，得到茯砖茶粗多糖fbtps。
8、(5)将步骤(4)中所得茯砖茶粗多糖经deae-sepharose fast flow柱层析分级，依次用去离子水、0.1m nacl溶液、0.3m nacl溶液和0.5m nacl溶液洗脱，每个洗脱等级洗脱3个柱体积。
9、(6)将步骤(5)中用0.3m nacl溶液洗脱的组分收集与合并，浓缩至合适的体积，去离子透析3天，真空冷冻干燥2天，最终得到茯砖茶多糖三号糖组分fbtps-3。
10、(7)将步骤(6)所得fbtps-3用分子排阻色谱检测其纯度，得到单一的对称峰型，表明得到的茯砖茶多糖为纯品。
11、本专利技术根据上述技术方案制备得到的fbtps-3，中性糖含量为48.63％，糖醛酸含量为52.14％，是一种由摩尔比为55.2∶16.5∶10.2∶8.9∶6.6∶2.5的半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖组成的分子量为20.5kda的杂多糖。
12、拟杆菌菌种的分离纯化，步骤如下：
13、(1)配制以0.2％fbtps-3为唯一碳源的基础培养基(20g/l胰蛋白胨、5.0g/l酵母提取物、5g/l nacl、5g/l k2hpo4、0.5g/l半胱氨酸、0.02g/l血晶素、2.0ml/l吐温80和10μl/l维生素k1)。
14、(2)挑选三位健康志愿者采集粪便，并用生理盐水制备粪便悬浮液，接种1％至步骤(1)所得培养基中。
15、(3)将步骤(2)中得到的已接种的培养基置于厌氧培养箱中厌氧发酵24h，其中厌氧培养箱的温度条件为37℃，气体条件为10％h2，5％co2，85％n2。
16、(4)将步骤(3)中得到的培养物用生理盐水稀释至10-1，10-2，10-3，10-4和10-5浓度，将其涂布于类杆菌-胆汁-七叶苷(bbe)琼脂培养基，并置于厌氧培养箱培养48h，培养条件与(3)中所述一致。
17、(5)将步骤(4)中培养的可疑菌落在bbe琼脂平板上进行分离划线培养，经过分离划线培养5代之后，得到单菌落。
18、(6)将步骤(5)中所得拟杆菌菌种进行一代测序进行鉴定，得到卵形拟杆菌(b.ovatus，genbank number：oq781165.1)、单形拟杆菌(b.uniformis，genbank number：or037385.1)、脆弱拟杆菌(b.fragilis，genbank number：oq781170.1)和多形拟杆菌(b.thetaiotaomicron，genbank number：or186207.1)。
19、茯砖茶多糖降解产物的制备，步骤如下：
20、(1)配制改良gam培养基来扩增四种拟杆菌菌种，此过程在厌氧培养箱中进行，厌氧培养箱的温度条件为37℃，气体条件为10％h2、5％co2、85％n2。在拟杆菌达到对数生长期时培养完成。
21、(2)配制以0.2％fbtps-3为唯一碳源的拟杆菌最小培养基(10g/l胰蛋白胨、17.5g/l牛心浸粉、5g/l nacl、2.5g/l na2hpo4·12h2o、0.5g/l半胱氨酸、1g/l na2co3、0.02g/l血晶素)，将(1)中处于对数生长期的四株拟杆菌以2％接种量接种至以0.2％fbtps-3为唯一碳源的拟杆菌最小培养基中，培养条件与(1)中所述一致。经过24h后，培养完成。
22、(3)将步骤(2)中所得发酵上清液收集(8000rpm、5min)，并将所得发酵上清液于35℃条件下减压浓缩至合适体积。
23、(4)将步骤(3)中所得浓缩液利用g25凝胶柱进行分离纯化，每次上样体积为2ml，用超纯水进行洗脱，流速为0.25ml/min，每20min收集一管洗脱液，利用苯酚硫酸法测定每管洗脱液中的总糖含量，并测定abs280。
24、(5)收集步骤(4)中总糖含量高，蛋白质含量低的洗脱液，并将洗脱液于45℃条件下减压浓缩至合适体积，经过冻干2天之后得到茯砖茶多糖的降解产物。
25、(6)步骤(5)中b.ovatus、b.uniformis、b.fragilis、b.thetaiotaomicron降解fptps-3后的主要降解产物分子量分别为1.1kda、1.4kda、3.0kda、1.5kda。
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【技术保护点】
1.拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法。
2.如权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征是，所述的茯砖茶多糖是由下述方法制备：
3.根据权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征在于，所述茯砖茶多糖其中性糖含量为48.63％，糖醛酸含量为52.14％，是一种由摩尔比为55.2∶16.5∶10.2∶8.9∶6.6∶2.5的半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖组成的分子量为20.5kDa的杂多糖。
4.根据权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征在于，所用的拟杆菌是由下述方法分离纯化得到：
5.根据权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征在于，所述四种拟杆菌可以降解FBTPS-3，并产生多糖降解产物，茯砖茶多糖降解产物是由下述方法制备得到：
【技术特征摘要】
1.拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法。
2.如权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征是，所述的茯砖茶多糖是由下述方法制备：
3.根据权利要求1所述的拟杆菌的分离与利用拟杆菌降解茯砖茶多糖的方法，其特征在于，所述茯砖茶多糖其中性糖含量为48.63％，糖醛酸含量为52.14％，是一种由摩尔比为55.2∶16.5∶10.2∶8.9∶6.6∶2.5的半乳...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾晓雄，石家萌，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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