【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域和食品领域，具体涉及一种促进骨桥蛋白在乳酸克鲁维酵母中表达的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
1、母乳是婴儿成长过程中必不可少的天然营养食物。母乳中拥有婴儿生长发育所需的多种营养物质和活性成分，其中骨桥蛋白(osteopontin，opn)又称分泌性磷蛋白-1(secreted phosphoprotein-1，spp-1)，是一种富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的磷酸化糖蛋白。母乳中的opn发挥了各种生物学作用，可以提高细胞活力，在伤口愈合中发挥着重要的作用；可以通过调节免疫反应抵御细菌、病毒等感染；opn还在肠道发育和神经系统发育等方面发挥着重要作用，因此是一种有重要价值的婴儿配方奶粉添加剂。
2、opn由一个单拷贝基因编码，在转录过程中，人源opn除可以获得全长序列外，还可以进行选择性剪接，产生两种各缺少一个外显子的剪接变体，分别被命名为opna亚型(全长)、opnb亚型(缺少外显子5)、opnc亚型(缺少外显子4)。此外，opn可以通过磷酸化、糖基化和蛋白水解加工等翻译后修饰作用，产生大量的opn修饰蛋白。opn在多种细胞类型和组织中表达，包括成骨前细胞、成骨细胞、骨细胞、树突状细胞、巨噬细胞、t细胞、肝细胞、骨骼肌、内皮细胞、脑和乳腺。opn具有细胞和组织特异性，不同细胞类型或不同条件下表达的opn在功能上存在差异，其作用机制尚不清楚。研究表明乳腺细胞中的opn不会发生选择性剪接，在牛乳和母乳中无法检测到选择性剪接的opn亚型，即母乳中的活性opn为全长亚型opna(以下简称opn
3、母乳中opn的浓度大约在130-180mg/l之间，远高于牛乳(约18mg/l)，而奶粉中opn浓度则低于10mg/l，因此需要在婴配奶粉中强化opn组分。天然opn含量较少，且会与牛乳中其他功能性蛋白结合，导致分离纯化过程复杂，成本高，效率低，不易进行大规模生产获得高纯度的蛋白。
4、利用基因工程进行蛋白的异源表达是实现opn工业化生产的有效途径，目前已有数个在不同蛋白表达系统中进行opn生产的报道。在chlamydomonas reinhardtii藻类蛋白表达系统中可以成功实现重组牛opn(rbopn)和重组人opn(rhopn)的表达(doi:10.1002/mnfr.202000644)。在烟草中生产重组人骨桥蛋白，每升可以获得9μgrhopn(doi:10.1038/s41598-017-17666-7)。在大肠杆菌表达体系中可获得大约30mg/l的rhopn(doi:10.1002/jcb.240540213)。在毕赤酵母表达系统中生产opnb亚型的产量约为32.2mg/l(cn116004701)。
5、上述表达系统生产的opn均存在一定程度的弊端。例如，大肠杆菌作为原核蛋白表达系统，缺乏有效的翻译后修饰，不能用于生产功能性的重组opn；在毕赤酵母中成功表达的opn为opnb亚型，并非母乳中功能性的全长亚型opna；藻类和烟草细胞中表达的opn的分离纯化的难度较高。
6、母乳opn异源表达后正确折叠的难度大，其复杂的翻译后修饰类型和水平也会影响蛋白的功能活性。现有技术的opn产量较低，难以实现产业化应用。目前尚没有利用融合蛋白协助全长亚型opna在食品安全酵母中表达的报道。
技术实现思路
1、目前尚未见在食品安全酵母中表达全长亚型opna的报道。本专利技术提供了在乳酸克鲁维酵母kluyveromyces lactic中构建opn表达载体的方法，通过融合蛋白的串联实现了opn的表达，为进一步实现其应用提供了一种可行的方法。
2、本专利技术的目的一是乳蛋白opn在乳酸克鲁维表达系统中的生产，通过串联融合蛋白提高opn的表达水平。本专利技术的目的二是提供所述重组乳酸克鲁维在表达生产opn蛋白中的应用。
3、本专利技术公开了一种促进骨桥蛋白在乳酸克鲁维酵母中表达的融合蛋白，所述的融合蛋白是将氨基酸序列seq id no.2或seq id no.3所示氨基酸的蛋白连接在骨桥蛋白的n端得到。由此可以提升opn在乳酸克鲁维表达系统中的表达水平，通过纯化可以获得opn蛋白。
4、其中，氨基酸序列如seq id no.2所示的来源于埃默森罗萨氏菌rasamsoniaemersonii的葡糖淀粉酶；氨基酸序列如seq id no.3所示的来源于homosapiens的白蛋白。所选的葡糖淀粉酶和白蛋白均为已报道可在乳酸克鲁维酵母中高效分泌表达的蛋白，本专利技术尝试和比较利用这些融合蛋白来提升opn表达水平的效果。
5、具体实施方式中，使用一段linker氨基酸序列：gagagagaga将融合蛋白与seq idno.8所示人源opn全长亚型序列串联。在opn序列的末尾添加his标签，用于后续的ni柱亲和层析纯化。
6、本专利技术在乳酸克鲁维酵母基因组lac4位点成功整合融合蛋白和opn的融合表达框。发酵实验表明，opn在融合蛋白的帮助下能显著提升表达水平。通过western blot和质谱验证，经纯化后opn表达量可达到2.5mg/l。本专利技术不仅实现了opn在乳酸克鲁维酵母中的表达，提供了可行的opn纯化方法，也提供了可增加opn表达量的策略。
7、本专利技术由此也提供所述融合蛋白的编码基因，编码所述的融合蛋白。
8、进而提供含有所述的编码基因的表达载体、重组宿主细胞。优选地，重组宿主细胞其是乳酸克鲁维酵母。
9、本专利技术也提供一种重组乳酸克鲁维酵母，其基因组上整合所述的编码基因。优选地，在乳酸克鲁维酵母基因组lac4位点含有所述的编码基因的表达框。
10、本专利技术最后还提供一种促进骨桥蛋白表达的方法，其是培养所述的重组乳酸克鲁维酵母，表达获得所述骨桥蛋白；任选地，还包括收集或纯化所述骨桥蛋白的步骤；优选地，在培养时在培养基中添加半乳糖作为诱导剂。
11、本专利技术opn的表达宿主乳酸克鲁维酵母被fda认定为食品安全级gras菌株，也是我国法律规定的保健食品生产安全菌株；乳酸克鲁维酵母碳源利用范围广，可以利用乳糖、半乳糖、棉子糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖以及一些不易被其他酵母利用的碳源如纤维二糖、山梨糖等获取能量。本专利技术在表达opn时使用的诱导剂为半乳糖，无食品安全隐患和生产安全隐患，更可以探索低价原料来降低生产成本，为获得功能性的opn蛋白提供保障。
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1.一种促进骨桥蛋白在乳酸克鲁维酵母中表达的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是将氨基酸序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示氨基酸的蛋白连接在骨桥蛋白的N端得到。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述促进骨桥蛋白是人源骨桥蛋白全长亚型，优选地其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，连接时使用一段连接肽，其氨基酸序列为GAGAGAGAGA。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，还包括标签序列，如HIS标签。
5.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，其编码如权利要求1至4任一项所述的融合蛋白。
6.一种含有如权利要求5所述的编码基因的表达载体、重组宿主细胞。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其是乳酸克鲁维酵母。
8.一种重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，其基因组上整合如权利要求5所述的编码基因。
9.如权利要求8所述的重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，在乳酸克鲁维酵母基因组LAC4位点成功含有如权利要求
10.一种促进骨桥蛋白表达的方法，其特征在于，培养如权利要求8或9所述的重组乳酸克鲁维酵母，表达获得所述骨桥蛋白；任选地，还包括收集或纯化所述骨桥蛋白的步骤；优选地，在培养时在培养基中添加半乳糖作为诱导剂。
...【技术特征摘要】
1.一种促进骨桥蛋白在乳酸克鲁维酵母中表达的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是将氨基酸序列seq id no.2或seq id no.3所示氨基酸的蛋白连接在骨桥蛋白的n端得到。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述促进骨桥蛋白是人源骨桥蛋白全长亚型，优选地其氨基酸序列如seq id no.8所示。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，连接时使用一段连接肽，其氨基酸序列为gagagagaga。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，还包括标签序列，如his标签。
5.一种融合蛋白的编码基因，其特征在于，其编码如权利要求1至4任一项所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，刘文婷，郑迎迎，商娜，梁庆玲，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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