本发明专利技术提供一种基于工程菌株ＢＬ２１－ＤＥ３发酵来获取５－羟基色氨酸的工艺。该工程菌株是利用已有报道的家兔Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ?ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ色氨酸羟化酶基因构建重组表达载体，通过质粒转化得到工程菌株。利用该菌株进行一步发酵工艺优化，在不纯化色氨酸羟化酶的条件下，通过发酵成熟期添加底物色氨酸获得最终产物５－羟基色氨酸，且原料易得，成本低，转化率大于７０％，收率大于８０％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物遗传工程领域，具体涉及一种将色氨酸羟化酶基因通过质粒转化 的方式转入菌株BL21-DE3，以及应用该菌株发酵得到5-羟基色氨酸的方法。
技术介绍
生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模 生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等的有效手段。5-羟基色氨酸(5HTP)是人体中重要的神经递质5-羟色胺的前体，5_羟色胺是脑 部分泌的一种荷尔蒙，会影响我们的情绪、睡眠和食欲，造成脑中的血清素不平衡时需5HTP 来维持身体处于正常状态。因此5HTP含量太低则容易忧郁、焦虑及睡眠失调。百忧解这类 的抗抑郁症药物，就是通过防止脑细胞太快耗尽血清素，进而导致5-羟色胺不足来达到治 疗目的的。但是，如果能够通过外源性的补充5HTP，即可在人体中制造出血清素，从而对维 持神经正常的重要物质和脑的功能都有帮助。同时，血清素还可以帮助睡眠，并且可以有效 的控制疼痛。因此5HTP也成功地被用来治疗睡眠失调。还有，由于血清素是褪黑激素(一 种调节睡眠和清醒周期的天然荷尔蒙)的前体，因此当血清素的含量提高时，褪黑激素的 含量也相应增加，使得睡眠更为香甜。所以，5HTP是一种天然而且安全的治疗和预防抑郁症 的有效化学物。既然5HTP和SSRI (抗抑郁药物)的作用类似，那么显然服用5HTP有很多后者无法 替代的好处，一是抗忧郁处方药大多比较昂贵；其二，处方药常会引起一些不良的副作用， 包括口干、焦虑及丧失性欲等等。因此，5HTP在欧美已成为最重要的抗抑郁补剂和非处方药 物。传统的5HTP生产方法包括两种，一种是从豆科植物尤其是原产非洲的加纳籽 (Griffonia Simplicifolia)中提取。如CN101648900专利中报道了以非洲产加纳籽为原 料，超临界萃取除油，除油后物料用水与醇类溶剂的混合溶液提取3-5次，合并提取液，经 超滤后用离子交换树脂吸附，洗脱，真空浓缩，低温结晶后得到高纯度5HTP干粉。该工艺是目前5HTP生产的主流工艺，工艺条件稳定，除醇和水之外没有其它有机 溶剂污染，产品纯度高。但是，该工艺生产成本完全依赖于原料加纳籽的产量和采收期，年 度生产不稳定，而且随着近年来非洲地区原料采收成本的增加，价格逐年走高，导致5HTP 生产成本居高不下，维持在1400元/公斤左右。另一种工艺是CN101323586报道的以色氨酸和羟基乙酸为原料，在高压反应釜中 进行化学羟化反应获得多羟基色氨酸，然后以色氨酸酶为催化剂在碱性条件下水解获得 5HTP的工艺。该工艺反应步骤多，获得5HTP的条件不稳定，需要严格的拆分纯化条件，而且 反应过程中能耗巨大，因此一直未能实现中试规模的生产。人体和其它哺乳动物体内合成5HTP的路径是以色氨酸为底物，在体内色氨酸羟 化酶的作用下特异性的生成5HTP。国内外已有报道对动物体内色氨酸羟化酶基因克隆并测 定DNA序列及其蛋白序列。因此，在CDNA文库中筛选相应的基因序列并利用成熟的质粒转化方法将该基因导入工程菌株进行大规模发酵生产，将使我们在体外获得大量的色氨酸羟 化酶并由此以色氨酸为底物生产5HTP成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5_羟基色氨酸的方 法。该工程菌株是利用已有报道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因构建重 组表达载体，通过质粒转化而得到。本专利技术只需进行一步发酵，在不纯化色氨酸羟化酶的条 件下，即可获得最终产物5-羟基色氨酸，且转化率大于70%，收率大于80%。本专利技术采用的具体技术方案如下一种利用工程菌株BL21-DE3发酵获取5-羟基色氨酸的方法，其特征在于工艺步 骤如下A、工程菌株BL21-DE3的增菌发酵按大肠杆菌的常规发酵条件及方法，将初始菌种接种入种子罐，TSB为基础培养 液，30°C下通气培养5小时后转入生产罐仍以TSB为基础培养液，调节PH值至7. 0，30°C下 通气培养12小时。B、发酵液中添加色氨酸底物后进行的次生代谢发酵在步骤A增菌发酵12小时之后，于发酵液中加入溶解在pH7. 8磷酸缓冲液中的色 氨酸溶液，使色氨酸最终浓度达到50% (w/w)，同时加入3 5g/L的吐温60阻滞菌体增殖， 在发酵罐中通气1-2小时后停止转化，通气量lL/min，温度为35°C，并用HPLC检测反应进程。C、发酵液中色氨酸/5_羟基色氨酸含量的监控用反相色谱柱DIM0NDC18(5ii m，4. 6X250ram)，检测波长为280nm，流动相为甲 醇水=15 85(v/v)，流速为l.OmL/分钟，进样量为20111，灵敏度0.0认皿3，柱温为室 温；以色谱峰面积积分值对浓度进行回归，得线性方程Y = -258332+1. 308413 X 106X (r =0.9991)，RSD = 0. 68%，5-羟基色氨酸含量在0. 8_4g/ml范围内，含量与峰面积积分值呈 良好的线性关系。D、发酵液5-羟基色氨酸的分离纯化发酵液停止转化后，离心收集上清液，调节pH值至5. 9，收集沉淀，以30% (w/w) 碳酸钠溶液溶解，溶液以HPD-400大孔吸附树脂对5-羟基色氨酸富集，上柱条件浓度为1.5mg/ml的5-羟基色氨酸，以500ml/分钟的速度通过HPD-400大孔吸附树脂柱，上样体 积与湿树脂的质量之比为2 1,40% (v/v)乙醇以500mL/min的流速洗脱，洗脱液体积与 湿树脂的质量之比为20 1 ；洗脱液再经直接过聚酰胺树脂分离除去底物L-色氨酸，上柱 条件浓度为1. Omg/ml的5-羟基色氨酸，以200ml/分钟的速度通过聚酰胺柱，5-羟基色 氨酸与聚酰胺树脂的重量比为0.25 1，上样体积与湿树脂的质量之比为2 1,20% (v/ v)乙醇以200mL/min的流速洗脱；洗脱液真空浓缩后，5-羟基色氨酸的平均质量含量为 83. 22% ；最后将浓缩液的醇浓度调整到35% (v/v)，在5 15°C的温度下1 3天结晶完 全得5-羟基色氨酸产物。所述5-羟基色氨酸第一次结晶物的纯度>90%，重结晶后的纯度>95%;与转化 前的L-色氨酸对比，5-羟基色氨酸的转化率> 85%，对第一次结晶物的回收率> 90%。所述工程菌株BL21-DE3由家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因构建 重组表达载体，通过质粒转化得到，具体方法如下 纯化提取来自兔脑组织勻浆基因组DNA，利用文献报道的家兔 Oryctolaguscimiculus色氨酸羟化酶基因序列设计引物进行克隆，克隆片段用BamHI内切 酶酶切，优化酶切条件，使酶切获得的片段在lkb-6kb之间。回收这些片段，连入到通过同 样处理的PUC18质粒上。连接产物转化大肠杆菌E. coli DH5a，转化后涂色氨酸显色平板。 筛选获得一株具有明显水解活力的克隆，提取质粒，BamHI酶切表明插入重组质粒上来自基 因组的片段为3kb，测序表明在该片段上有一个完整的ORF阅读框架，测序表明该基因与文 献报道的兔色氨酸羟化酶基因具有同源性。利用上述基因序列设计PCR模板，构建PET30 质粒，将构建好的质粒通过电转化法导入大肠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用工程菌株ＢＬ２１－ＤＥ３发酵获取５－羟基色氨酸的方法，其特征在于工艺步骤如下：Ａ、工程菌株ＢＬ２１－ＤＥ３的增菌发酵按大肠杆菌的常规发酵条件及方法，将初始菌种接种入种子罐，ＴＳＢ为基础培养液，３０℃下通气培养５小时后转入生产罐仍以ＴＳＢ为基础培养液，调节ＰＨ值至７．０，３０℃下通气培养１２小时；Ｂ、发酵液中添加色氨酸底物后进行的次生代谢发酵在步骤Ａ增菌发酵１２小时之后，于发酵液中加入溶解在ｐＨ７．８磷酸缓冲液中的色氨酸溶液，使色氨酸最终浓度达到５０％；，同时加入３～５ｇ／Ｌ的吐温６０阻滞菌体增殖，在发酵罐中通气１－２小时后停止转化，通气量１Ｌ／ｍｉｎ，温度为３５℃，并用ＨＰＬＣ检测反应进程；Ｃ、发酵液中色氨酸／５－羟基色氨酸含量的监控用反相色谱柱ＤＩＭＯＮＤＣ１８（５μｍ，４．６Ｘ ２５０ｒａｍ），检测波长为２８０ｎｍ，流动相为甲醇∶水＝１５∶８５（ｖ／ｖ），流速为１．０ｍＬ／分钟，进样量为２０μｌ，灵敏度０．０１ＡＵＦＳ，柱温为室温；以色谱峰面积积分值对浓度进行回归，得线性方程Ｙ＝－２５８３３２＋１．３０８４１３×１０６Ｘ（ｒ＝０．９９９１），ＲＳＤ＝０．６８％，５－羟基色氨酸含量在０．８－４ｇ／ｍｌ范围内，含量与峰面积积分值呈良好的线性关系；Ｄ、发酵液５－羟基色氨酸的分离纯化发酵液停止转化后，离心收集上清液，调节ｐＨ值至５．９，收集沉淀，以３０％碳酸钠溶液溶解，溶液以ＨＰＤ－４００大孔吸附树脂对５－羟基色氨酸富集，上柱条件：浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ的５－羟基色氨酸，以５００ｍｌ／分钟的速度通过ＨＰＤ－４００大孔吸附树脂柱，上样体积与湿树脂的质量之比为２∶１，４０％乙醇以５００ｍＬ／ｍｉｎ的流速洗脱，洗脱液体积与湿树脂的质量之比为２０∶１；洗脱液再经直接过聚酰胺树脂分离除去底物Ｌ－色氨酸，上柱条件：浓度为１．０ｍｇ／ｍｌ的５－羟基色氨酸，以２００ｍｌ／分钟的速度通过聚酰胺柱，５－羟基色氨酸与聚酰胺树脂的重量比为０．２５∶１，上样体积与湿树脂的质量之比为２∶１，２０％乙醇以２００ｍＬ／ｍｉｎ的流速洗脱；洗脱液真空浓缩后，再将浓缩液的醇浓度调整到３５％，在５～１５℃的温度下１～３天结晶完全得５－羟基色氨酸产物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建军，
申请(专利权)人：成都圣凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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