【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及一种筛选和改造具有玉米赤霉烯酮内酯酶活性的酶的方法以及所得到的突变体酶，更具体的，关于其重组表达载体与重组表达菌株的构建，以及它们的制备方法和应用。
技术介绍
1、玉米赤霉烯酮(zhd)是一种重要的雌激素毒素，广泛存在于许多粮食作物中，严重影响粮食的安全性和产量。
2、目前，除了采取避免真菌感染、合理使用杀菌剂等预防措施外，发展安全高效的zhd降解方法是控制zhd污染的关键。利用酶法降解zhd是一条环境友好的途径。已经发现和研究了一些可以降解zhd的酶，其中玉米赤霉烯酮内酯酶(zhd)就是一种关键酶，它可以特异性地水解zhd分子，将其转化为无毒代谢产物。
3、zhd属于α/β-螺旋蛋白酶超家族，采用α/β液泡的三维结构。其催化机制由三步反应组成：1)底物与酶活性中心中的ser残基发生酯化作用；2)glu或asp残基对酯键进行酸解催化；3)酶与底物产物断离。zhd表现出较高的底物专一性，主要识别和作用于zhd和其类似化合物。然而，zhd的降解活性和效率还不足以满足实际应用需求。
4、虽然zhd表现出一定的降解活性，但其降解效率和范围还有待提高，限制了其广泛应用。通过蛋白质工程手段改造zhd，获得其高活性突变体，不仅有助于深入理解zhd的催化机制，也可以获得更加高效的酶制剂，用于更加全面和深入地控制zhd污染。比如：us20180093166a1提供了一种从真菌中提取分离出来的lactonase，在降解多种镰刀菌属产生毒素方面具有应用价值。但是该专利技术并没有涉及
5、在获得zhd高活性突变体方面，目前主要采用定向进化、随机突变等方法。定向进化可以改善zhd对底物的识别性和结合力，进而提高其降解活性。随机突变则更侧重获得新的突变体系，增加获得高活性zhd的机会。无论何种方法，都需要建立高通量的筛选系统来精确而有效地评价不同zhd突变体的降解活性，这也是获得高活性zhd突变体的关键步骤。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的是提出一种高活性、高产的玉米赤霉烯酮内酯酶及基因、重组表达载体、高产菌株，以及它们的制备方法，旨在为玉米赤霉烯酮内酯酶的产业化及应用奠定基础。
2、为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd，所述玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的氨基酸序列如seq id no：1所示。
3、根据本专利技术，所述玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd是原始玉米赤霉烯酮内酯酶5c8z的突变体，其为来自clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮内酯酶(genbank登录号：5c8z_a)。所述原始玉米赤霉烯酮内酯酶5c8z的氨基酸序列如seq id no：3所示，原始玉米赤霉烯酮内酯酶基因5c8z的核苷酸序列如seq id no：4所示。为提高其活性、蛋白质结构的稳定性和表达量。通过蛋白质理性设计的方式对其中的三个氨基酸进行了突变。获得具有新的氨基酸序列的玉米赤霉烯酮内酯酶。所述玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的氨基酸序列如seq idno：1所示。具体的设计包括：通过定点突变的方法将原始玉米赤霉烯酮内酯酶5c8z序列中第11位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(n11d)，第22位的苏氨酸突变为丝氨酸(t22s)，第29位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v29i)，以及第261位的谷氨酰胺突变为精氨酸(q261r)。所述定点突变技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。
4、本专利技术的第二方面提供一种玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，用于编码所述的玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd，所述玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的核苷酸序列与seq id no：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。
5、优选地，根据本专利技术，所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd含有seq id no：2所示的碱基序列即可实现本专利技术的效果。在最优情况下，本专利技术所述的玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的碱基序列为seq id no：2所示的碱基序列。
6、本专利技术提供的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，系基于crzhd氨基酸序列人工设计合成而来。在设计玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd时，以crzhd的氨基酸序列为模板，选择简并密码子中在毕赤酵母中高频使用的密码子来翻译所对应的氨基酸，显著提高了人工设计的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的密码子使用频率，有助于提高crzhd在毕赤酵母细胞中的表达量。所设计的crzhd通过人工合成的方法获得，其碱基序列如seq id no：2所示，命名为crzhd。玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd以玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的氨基酸序列为基础，以酵母密码子使用频率为参考，适配表达宿主，采用氨基酸的简并密码子中的高频密码子来翻译对应的氨基酸，进一步提高了人工定向改造后的玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd在酵母细胞中的表达量。
7、本专利技术的第三方面提供一种重组表达载体，包括如上所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd。除此之外，还可包括其他功能单元。在玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的氨基酸序列和玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。
8、本专利技术的第四方面提供所述的重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：将所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的两端分别引入限制性内切酶ecor i和xba i，得到双酶切的脂肪酶基因片段；将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体。
9、优选地，所述表达载体为毕赤酵母表达载体ppiczαa。
10、根据本专利技术一种具体实施方式，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：将玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd分别用限制性内切酶ecor i和xba i双酶切，得到具有粘性末端的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd片段；将毕赤酵母表达载体ppiczαa分别用限制性内切酶ecor i和xba i双酶切，得到具有粘性末端的载体ppiczαa片段；将所述具有粘性末端的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd片段和所述具有粘性末端的载体ppiczαa片段通过t4dna连接酶连接，获得玉米赤霉烯酮内酯酶重组表达载体ppic-crzhd。除ppic-crzhd外，在本专利技术其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。
11、本专利技术的第五方面提供一种重组表达菌株，包括如上所述的重本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，用于编码如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的核苷酸序列与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。
3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，其中，所述玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd。
5.权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和XbaI，得到双酶切的脂肪酶基因片段；将所述双酶切的脂肪酶基因片段插入表达载体中，得到重组表达载体；所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。
6.一种重组表达菌株，其特征在于
7.权利要求6所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4所述的重组表达载体线性化后导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。
8.根据权利要求7所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母。
9.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求6所述的重组表达菌株，从培养物中获得玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD。
10.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮内酯酶CrZHD在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.一种玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，用于编码如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮内酯酶crzhd，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的核苷酸序列与seq id no：2所示的核苷酸序列具有95％以上的同一性。
3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd，其中，所述玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的核苷酸序列如seq id no：2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd。
5.权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮内酯酶基因crzhd的两端分别引入限制性内切酶ecor ...
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