【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑领域，本专利技术公开了一种新型双碱基编辑器ragbe及其合成方法与应用。
技术介绍
1、许多重要农艺性状的改良与单核苷酸变异(snv)有关。碱基编辑器(be)系统能够在不诱导dna双链断裂(dsb)的情况下进行碱基转换，因此被认为是产生snv相关饱和突变群体的有力工具。目前，cbe(胞嘧啶碱基编辑器)、abe(腺嘌呤碱基编辑器)、gbe(糖基化酶碱基编辑器)分别用于催化c-g转化为t-a、a-t转化为g-c和c-g转化为g-c的碱基对。
2、abe重要元件载体示意图示例：-nls-linker-tada8e-linker-cas9n-linker-nls
3、abe(a-to-g)，腺嘌呤碱基编辑器，包含腺嘌呤脱氨酶，能够靶向识别dna序列的核酸酶(如可以识别ngg pam的cas9n蛋白与没有pam限制的cas9n的变体spryn)。cas9n蛋白识别pam，打开dna双链，腺嘌呤脱氨酶对腺嘌呤(a)进行脱氨形成次黄嘌呤(i)，随后的dna复制中，i碱基被dna聚合酶识别为g，从而造成dna中原本的a-t碱基对变为g-c碱基对。
4、cbe重要元件载体示意图示例：-nls-linker-anc689-linker-ncas9-linker-ugi-linker-nls
5、cbe(c-to-t)：胞嘧啶碱基编辑器,包含胞嘧啶脱氨酶(如pmcda1以及本专利技术中应用的anc689)，能够靶向识别dna序列的核酸酶(如可以识别ngg pam cas9n蛋白与没
6、gbe重要元件载体示意图示例：-nls-linker-anc689-linker-cas9n-linker-ung-linker-nls
7、gbe(c-to-g)糖基化酶碱基编辑器，包含胞嘧啶脱氨酶(如pmcda1以及本专利技术中应用的anc689)，能够靶向识别dna序列的核酸酶(如识别ngg pam cas9n蛋白与没有pam限制的cas9n的变体spryn)，尿嘧啶糖基化酶(如hung，rung以及本专利技术中用的udgx)。cas9蛋白识别pam，打开dna双链，胞嘧啶脱氨酶对胞嘧啶(c)进行脱氨形成尿嘧啶(u)，随后，尿嘧啶糖基化酶会切割u碱基，形成无碱基位点(ap位点)，在随后的修复中，ap位点被随机掺入碱基，但由于掺入碱基的偏好性，gbe能诱导c-to-g碱基转换，同时诱导包括c-to-t、c-to-a转换的副产物。
8、acbe重要元件载体示意图示例：-nls-linker-anc689-linker-tada8e-linker-cas9n-linker-ugi-ugi-linker-nls
9、acbe，近年来有不少acbe双碱基编辑器，如space,stemes,target-acemax等，这些都是abe和cbe的融合，仅能同时实现a-to-g与c-to-t的共同转换，转化类型仅限于此，不能满足农业发展需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种新型双碱基编辑器ragbe及其构建与应用，其可以解决现有技术中碱基同时转换类型少，仅能实现a-to-g与c-to-t的同时转换的缺点。
2、本专利技术采用以下技术方案：
3、一种新型双碱基编辑器ragbe，包括元件载体，所述元件载体包括：腺嘌呤脱氨酶，胞嘧啶脱氨酶，能够靶向识别dna序列的核酸酶和尿嘧啶糖基化酶。
4、所述ragbe碱基编辑器为-nls1-anc689-l1-tada8e-l1-cas9n-l2-udgx-nls2或-nls1-anc689-l1-tada8e-l1-spryn-l2-udgx-nls2。
5、l1与l2表示不同的连接序列
6、nls1与nls2表示不同的核定位信号；
7、anc689表示一种胞嘧啶脱氨酶
8、tada8e表示一种腺嘌呤脱氨酶
9、cas9n表示一种能够靶向识别dna序列的核酸酶，pam为ngg
10、spryn表示一种cas9n的变体，无pam限制
11、udgx表示一种尿嘧啶糖基化酶。
12、一新型双碱基编辑器ragbe的合成方法，包括以下步骤：
13、udgx进行水稻密码子优化并合成，将udgx取代cbemax中的ugi，获得gbe载体，从rabe8e扩增tada8e+l1，从cbemax扩增cas9n-l2序列，从gbe中扩增udgx-nls2，将上述扩增序列与spe i-bamh i酶切的cbemax进行同源重组，获得ragbe-ngg载体，分别从rabe8e-spry和ragbe-ngg中扩增tada8e-l1-spryn和l2-udgx–nls2，并与spe i-bamh i酶切的cbemax同源重组，获得ragbe-spry载体；用到的靶序列，即sgrna为：
14、sgrna-1为ctgtacaccaccaaaagtgg，pam为agg
15、sgrna-2为tgctgacatgcatgccctta，pam为tgg
16、sgrna-3为gtgtacagtagggggagatg，pam为cat
17、sgrna-4为ataaaccccctccaaccagg，pam为tgc
18、sgrna-5为gctgacatgcatgcccttat，pam为ggt
19、一种新型双碱基编辑器ragbe的应用，ragbe碱基编辑器不仅保留了原有双碱基编辑器所具有的a-to-g与c-to-t的同时转换功能，还可实现c-to-g、c-to-t和a-to-g任意组合的同时转换。
20、碱基编辑器ragbe-spry无pam限制。
21、所述应用为作物改良、定向进化和基础研究。
22、本专利技术的优点是：
23、1、ragbe碱基编辑器不仅保留了现有技术中a-to-g与c-to-t的共同编辑；还可实现c-to-g、c-to-t和a-to-g任意组合的同时转换。
24、2、同时构建了ragbe-spry,无pam限制，适用性更强。
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1.一种新型双碱基编辑器rAGBE，其特征在于，包括元件载体，所述元件载体包括：腺嘌呤脱氨酶，胞嘧啶脱氨酶，能够靶向识别DNA序列的核酸酶和尿嘧啶糖基化酶。
2.根据权利要求1所述的新型双碱基编辑器，其特征在于，所述rAGBE碱基编辑器为-NLS1-Anc689-L1-TadA8e-L1-Cas9n-L2-UDGX-NLS2或
3.一种如权利要求1或2所述的新型双碱基编辑器的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.一种如权利要求1或2所述的新型双碱基编辑器的应用，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的新型双碱基编辑器的应用，其特征在于，碱基编辑器rAGBE-SpRY无PAM限制。
6.根据权利要求4所述的新型双碱基编辑器的应用，其特征在于，所述应用为作物改良、定向进化和基础研究。
【技术特征摘要】
1.一种新型双碱基编辑器ragbe，其特征在于，包括元件载体，所述元件载体包括：腺嘌呤脱氨酶，胞嘧啶脱氨酶，能够靶向识别dna序列的核酸酶和尿嘧啶糖基化酶。
2.根据权利要求1所述的新型双碱基编辑器，其特征在于，所述ragbe碱基编辑器为-nls1-anc689-l1-tada8e-l1-cas9n-l2-udgx-nls2或
3.一种如权利要求1或...
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