一种血浆中痕量醛固酮的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，包括配制定标曲线，醛固酮提取，醛固酮衍生，得到的样本上清液经液相色谱三重四级杆串联质谱仪测定，获得醛固酮分析检测结果

【技术实现步骤摘要】
一种血浆中痕量醛固酮的检测方法


[0001]本专利技术属于检测
，涉及醛固酮的检测方法，尤其涉及一种血浆中痕量醛固酮的检测方法
。

技术介绍

[0002]原发性醛固酮增多症
(Primary Aldosteronism)
简称原醛症
PA
，是一种常见的内分泌性高血压，高血压患者中占比高达
10
％甚至
15
％，在难治性高血压人群中甚至达
20
％
。
原醛症主要是指肾上腺皮质病变
(
肾上腺皮质肿瘤或增生
)
导致醛固酮自主分泌增多，导致潴钠排钾
、
体液容量扩张而抑制肾素
‑
血管紧张素系统
(RAS)
的一种综合症，以血浆高醛固酮和低肾素为主要特征，是临床上最常见的继发性高血压致病原因之一，其主要病因包括：醛固酮瘤和特发性醛固酮增多症
。
醛固酮的高分泌是致心力衰竭
、
肾功能受损和脑卒中等危险因素，与原发性高血压患者相比，原醛症患者多器官损害更严重，更易患心脑血管及肾脏疾病，原醛患者发生脑卒中
、
心力衰竭
、
心肌梗死
、
心律失常
、2
型糖尿病及阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的风险更高
。
因此，早期诊断和治疗将给患者带来极大获益，但由于原醛的临床表现较为隐匿，目前绝大部分患者仍然未被发现和给予正确的治疗/>。
原发性醛固酮增多症诊断治疗的共识以及原醛诊疗指南中建议，对所有高血压患者应进行原醛的筛查，尤其难治性高血压
、
新诊断高血压
、
高血压合并自发性或利尿药诱发低钾血症
、
或肾上腺意外瘤
、
或一级亲属患原醛症
、
睡眠呼吸暂停综合征
、
早发高血压或心血管事件家族史
(<40
岁
)
等情形
。
相关共识及指南均推荐血浆醛固酮
/
肾素活性
(ARR)
是原醛症的最有效筛查指标，作为首选筛查指标，其中肾素活性＝血管紧张素
I(37℃)
‑
血管紧张素
I(4℃)。
[0003]液相色谱串联质谱法
LC
‑
MS/MS
是近些年发展极为迅速的一门新兴技术，是一种通过制备
、
分离
、
检测气相离子来鉴定并定量化合物的专门技术，所能检测的范围非常广泛，涵盖维生素
、
激素
、
氨基酸
、
血药浓度
、
儿茶酚胺等多种小分子以及肽段
、
蛋白质
、
核酸等生物大分子；其分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的
。
液相色谱串联质谱法
LC
‑
MS/MS
具有分析速度快
、
灵敏度高
、
准确度高
、
特异性强
、
多指标同时分析等优势，且仅需微量的样本，最大程度上规避了传统检测方法的诸多问题与不足，被誉为小分子定量分析的“金标准”，极大优化了临床操作，性能稳定
、
安全性高，已逐渐应用到临床检测和辅助诊断，为精准医疗提供技术支持
。
[0004]目前国内普遍采用放射免疫法检测血醛固酮和尿醛固酮
。
醛固酮检测方法均为放射免疫法，但是随着质谱检测技术的逐步成熟和完善，也陆续有医院实验室积极探索新的检测技术手段，其中基于
LC
‑
MS/MS
质谱平台开展的醛固酮检测已经开始应用于临床，质谱检测技术可为相关指标的测定提供必要的灵敏度和特异性
。
[0005]血液中的醛固酮醛固酮含量水平非常低，为
pg/mL
级，因此准确测定血液中的醛固酮对检测方法的灵敏度有较高的要求
。
免疫方法检测中，醛固酮等会与其它结构类似的类固醇激素发生抗体交差反应，造成检测结果不准确且不同免疫测试结果时常不统一，准确度低，极容易导致误诊发生
。
[0006]中国专利申请公布号
CN110865137A
，专利技术名称“一种血浆中醛固酮检测方法及检测试剂盒”，采用了液液萃取方法测定血浆中的醛固酮，但是液液萃取基质干扰仍然会非常严重，检测灵敏度差，该方法的定量下限仅做到
50pg/mL。
[0007]中国专利申请公布号
CN110702829A
，专利技术名称“一种测定血浆或血清中醛固酮的含量方法”，采用固相萃取法测定血浆和血清中的醛固酮，采用负离子模式检测，能使醛固酮的定量限达到
10pg/mL
，但需要高端性能的质谱
。
[0008]中国专利申请公布号
CN114720575A
，专利技术名称“一种人血浆或血清中醛固酮的检测方法”，优化了前处理条件及色谱条件，使醛固酮的定量限达到
7.5pg/mL
，该方法对实际低浓度的样本仍然无法准确定量
。
[0009]目前基于
LC
‑
MS/MS
技术开发的用于血液中醛固酮的的检测和专利各有各的优点，但仍然具有以下缺点：
1、
样本用量大，不利于临床推广；
2、
醛固酮在质谱上离子化效率低，定量限较高，且对质谱仪器的性能要求较高，需要高端性能的质谱仪器；
3、
临床质谱检测方法中，衍生法检测醛固酮浓度的方法尚未见报道，衍生法可以解决以下两个问题，即用正离子模式检测没有合适的离子对可供选择，负离子模式检测需要高端质谱
。

技术实现思路

[0010]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，本专利技术建立了一种高灵敏度的基于
LC
‑
MS/MS
的血浆中醛固酮含量测定方法，满足临床痕量样本的检测需求
。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]本专利技术提供了一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0013]1)
配制定标曲线：醛固酮用甲醇配制定标曲线，保存备用；
[0014]2)
醛固酮提取：取
50
‑
100
μ
L
血浆样本，分别加入1‑
10
μ
L
醛固酮内标溶液，
200
‑
300
μ
L
醛固酮释放剂，振荡提取后加入醛固酮缓冲剂过固本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
1)
配制定标曲线：醛固酮用甲醇配制定标曲线，保存备用；
2)
醛固酮提取：取
50
‑
100
μ
L
血浆样本，分别加入1‑
10
μ
L
醛固酮内标溶液，
200
‑
300
μ
L
醛固酮释放剂，振荡提取后加入醛固酮缓冲剂过固相萃取柱，依次用水
、
醛固酮缓冲剂
、20
％甲醇水淋洗后，乙腈洗脱，洗脱液转移至离心管中，氮气吹干；
3)
醛固酮衍生：在步骤
2)
氮吹后的离心管中加入
30
‑
60
μ
L
醛固酮衍生液，振荡反应，加入乙酸水溶液与甲基叔丁基醚，震荡提取，取上清液于离心管中，氮吹干后加入
50
％甲醇水溶液，震荡混匀后，离心，得到样本上清液；
4)
将步骤
3)
得到的样本上清液经液相色谱三重四级杆串联质谱仪测定，获得醛固酮分析检测结果
。2.
根据权利要求1所述的一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，步骤
1)
中，醛固酮定标曲线浓度为
1pg/mL
，
2pg/mL
，
5pg/mL
，
10pg/mL
，
20pg/mL
，
100pg/mL
以及
200pg/mL。3.
根据权利要求1所述的一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，步骤
2)
中，醛固酮释放剂为盐酸与甲醇按照
1:3
～
10
体积混合的混合液
。4.
根据权利要求1所述的一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，步骤
2)
中，醛固酮缓冲剂为质量分数2‑
20
％碳酸氢钠溶液
。5.
根据权利要求1所述的一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，步骤
3)
中，醛固酮衍生液的配制方法为：将
10
～
50mg 2
‑
吡啶甲酰氯溶于
1mL
二甲基亚砜溶液中
。6.
根据权利要求1所述的一种血浆中痕量醛固酮的检测方法，其特征在于，步骤
3)
中，加入醛固酮衍生液后，在
60℃
，
800rpm

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，薛建有，高强，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：