一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法与体系技术

本发明专利技术公开了一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法与体系，本发明专利技术通过固定于固相载体的捕获试剂可通过靶标的第一结合位点与样本中待测靶标进行特异性结合，实现靶标富集；加入能与靶标第二结合位点结合的检测试剂，该检测试剂含有与引导RNA互补结合的特异性核酸序列，随着CRISPR/Cas反应体系的加入，激活Cas蛋白活性，对激发序列进行切割的同时，对ssDNA进行切割，释放报告基团，经光激发后进行荧光检测。荧光信号的强度与检测靶标浓度呈正比，通过检测荧光信号而计算出原始样本中靶标浓度。经过Cas蛋白的酶切信号放大技术，可以对样本中微量存在的靶标进行检测，提高了检测的灵敏度。敏度。敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法与体系


[0001]本专利技术属于检测
，涉及蛋白质的检测，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas系统进行样品中目标分析物超灵敏检测的方法与体系。

技术介绍

[0002]人体内蛋白质的变化与人体健康和疾病的发生、发展具有密切的关系。准确测定人体内与疾病相关的蛋白质含量的变化，在疾病预防、筛查和精准诊断以及治疗等方面具有重要意义。
[0003]基于免疫学技术的检测方法是目前对于蛋白质检测的主要方法，其中酶联免疫检测是应用最广泛的免疫检测方法。该方法是在二抗上标记催化酶，将抗原抗体的特异性反应与酶催化底物的作用结合起来，根据催化底物的显色反应，来判断检测结果。该方法无需特殊的仪器，检测简单，应用广泛。但是，由于酶催化底物信号放大作用的限制，该方法对于靶标检测的敏感度较低，仅能达到ng级水平，对于更低水平的(如pg级)蛋白质检测存在困难。
[0004]随着技术的发展，Quanterix开发了一种数字式单分子免疫阵列分析仪(Simoa技术)，该技术通过将免疫复合物捕获并密封在一个含有20万个飞升级别小孔的芯片中进行反应，可直接对血清和血浆中的蛋白质及核酸等进行超高灵敏度检测，但是该方法需要用到昂贵的检测设备，检测操作技术要求较高，不利于临床普及检测。因此，亟需开发一种操作简便、成本低的检测方法用于大规模临床检测。
[0005]CRISPR/Cas系统，是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵。为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA。该系统最核心由两个部分组成：CRISPR序列与CAS(CRISPR associate system)。CRISPR序列是由可以感染原核生物的噬菌体DNA片段衍生来的。它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的DNA。CAS是一种核酸内切酶，可以利用CRISPR序列中间隔序列(spacer)对应的RNA指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链。CRISPR
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Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为两类，Class1(包含了typeI，III，andIV)和Class2(包含了typeII和typeV和typeVI)。在Class 1中，对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物(由不止一种Cas蛋白组成)和引导RNA；在Class 2中，对于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白，例如TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白。在实际应用过程中，由于第2类系统的简便性和高效性，在核酸检测和诊断、基因编辑、基因筛选等方面得到了广泛的应用。
[0006]研究发现Cas12和Cas13家族具备collateral cleavage能力(或称为cleavage in trans)，即Cas蛋白
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crRNA二元复合体识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意单链核酸序列(如ssDNA)。由此可以对ssDNA进行修饰(如，荧光染料发射对修饰，一端为荧光基团，另一端为淬灭基团)，通过Cas蛋白对ssDNA的切割产生信号，借助简单的信号检测系统进行信号检测；同时，借助于CRISPR/Cas系统的酶切信号放大作用，可以
对微量靶标信号进行放大，提高检测灵敏度。该方法仅需在传统酶联免疫方法的基础上进行稍微的改变，不需昂贵的设备，操作也比较简单，更适合临床普及检测。

技术实现思路

[0007]为了解决现有蛋白质检测耗时、成本高(需要特殊的仪器)、检测不够灵敏(无法进行信号放大)，无法自动化等问题，本专利技术提供了一种基于CRISPR/Cas系统进行样品中目标分析物超灵敏检测的方法，本专利技术的方法操作简便、成本低的，效率高。
[0008]固定于固相载体的捕获试剂可通过靶标的第一结合位点与样本中待测靶标进行特异性结合，进而实现靶标富集；然后加入能与靶标第二结合位点结合的检测试剂，该检测试剂含有与引导RNA互补结合的特异性核酸序列(以下简称“激发序列”)，随着CRISPR/Cas反应体系的加入，可激活Cas蛋白活性，对激发序列进行切割的同时，可对ssDNA进行切割，释放ssDNA上结合的报告基团(如荧光基团)，经光激发后可进行荧光检测。因为酶切反应是持续进行的，并且荧光信号的强度与检测靶标浓度呈正比。因此可通过检测荧光信号而计算出原始样本中靶标浓度。此外，经过Cas蛋白的酶切信号放大技术，可以对样本中微量存在的靶标进行检测，提高了检测的灵敏度。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]1)捕获试剂固定：将能够特异性与样品中待测物质第一结合位点结合的捕获试剂固定在载体上，形成载体
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捕获试剂复合物；
[0012]2)封闭：将捕获试剂固定于载体后，对其表面进行封闭处理；
[0013]3)捕获抗原：将步骤2)封闭后的载体
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捕获试剂复合物与样品混合进行抗原捕获；
[0014]4)检测试剂结合：孵育结束后，去除上清并用清洗缓冲液清洗3～6次，然后加入检测试剂孵育，使检测试剂与捕获的靶标特异性结合，形成捕获试剂
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靶标
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检测试剂复合体；所述检测试剂能够与靶标第二结合位点特异性结合并含有与引导RNA互补结合的特异性核酸序列；
[0015]5)Cas蛋白反应体系：主要由Cas蛋白、引导RNA序列、报告探针及缓冲体系组成；在进行反应前，将Cas蛋白与引导RNA序列在缓冲体系中组装成Cas
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引导RNA复合体，报告探针可同时加入Cas蛋白反应体系或者是单独加入；
[0016]6)信号检测：反应完成后，对检测产生的信号进行检测，得到结果。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，步骤1)中，所述样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、组织液、尿液、淋巴液、房水或者处理液；所述待测物质包括蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物；所述捕获试剂是指可特异性与待测物质发生结合的试剂；所述载体包括尼龙、纤维素、微孔板、磁珠、芯片、离心管或者纳米微球。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，捕获试剂与载体的连接为共价结合或者非共价结合；其中，共价结合是指在载体表面带有或者是经修饰后有氨基、羟基、羧基、巯基、磺酰基、环氧基一种或几种官能团，与捕获试剂或修饰后的捕获试剂通过共价键进行结合；非共价结合是指捕获试剂或修饰后的捕获试剂通过氢键、静电相互作用、疏水作用力、范德华力吸附在载体表面。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，步骤2)中，所述封闭剂包括BSA、酪蛋白或吐温。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，步骤3)中，进行抗原捕获的条件为温度25
‑
37℃，时间10
‑
180min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)捕获试剂固定：将能够特异性与样品中待测物质第一结合位点结合的捕获试剂固定在载体上，形成载体
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捕获试剂复合物；2)封闭：将捕获试剂固定于载体后，对其表面进行封闭处理；3)捕获抗原：将步骤2)封闭后的载体
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捕获试剂复合物与样品混合进行抗原捕获；4)检测试剂结合：孵育结束后，去除上清并用清洗缓冲液清洗3～6次，然后加入检测试剂孵育，使检测试剂与捕获的靶标特异性结合，形成捕获试剂
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靶标
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检测试剂复合体；所述检测试剂能够与靶标第二结合位点特异性结合并含有与引导RNA互补结合的特异性核酸序列；5)Cas蛋白反应体系：主要由Cas蛋白、引导RNA序列、报告探针及缓冲体系组成；在进行反应前，将Cas蛋白与引导RNA序列在缓冲体系中组装成Cas
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引导RNA复合体，报告探针可同时加入Cas蛋白反应体系或者是单独加入；6)信号检测：反应完成后，对检测产生的信号进行检测，得到结果。2.根据权利要求1所述的一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，步骤1)中，所述样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、组织液、尿液、淋巴液、房水或者处理液；所述待测物质包括蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物；所述捕获试剂是指可特异性与待测物质发生结合的试剂；所述载体包括尼龙、纤维素、微孔板、磁珠、芯片、离心管或者纳米微球。3.根据权利要求1或2所述的一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，捕获试剂与载体的连接为共价结合或者非共价结合；其中，共价结合是指在载体表面带有或者是经修饰后有氨基、羟基、羧基、巯基、磺酰基、环氧基一种或几种官能团，与捕获试剂或修饰后的捕获试剂通过共价键进行结合；非共价结合是指捕获试剂或修饰后的捕获试剂通过氢键、静电相互作用、疏水作用力、范德华力吸附在载体表面。4.根据权利要求1所述的一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，步骤2)中，所述封闭剂包括BSA、酪蛋白或吐温。5.根据权利要求1所述的一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，步骤3)中，进行抗原捕获的条件为温度25
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37℃，时间10
‑
180min。6.根据权利要求1所述的一种样品中目标分析物超灵敏检测的方法，其特征在于，步骤4)中，所述检测试剂包括适配体或抗体；当检测试剂为适配体时，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，牛成镇，高强，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：