一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒，包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪进行分离，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据。本发明专利技术选择以随机尿液样本为检测对象，解决临床门诊患者依从度差，收样困难弊端，不增加肌酐检测实验，8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物与丹磺酰氯反应后生成稳定的衍生物，再经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度，本发明专利技术的检测方法简单快捷、准确高效，临床应用价值高。临床应用价值高。临床应用价值高。

【技术实现步骤摘要】
一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于分析检测
，涉及儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测，尤其涉及一种随机尿液样本中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]高血压可造成脑卒中、心肌梗死、心力衰竭、引发死亡等恶性事件，成为威胁人类健康的主要疾病；继发性高血压约占总高血压10％左右；高血压的诊断评估中需判断高血压的原因，区分原发性或继发性高血压，及时作出高血压病因的鉴别诊断并积极针对病因进行治疗：且新诊断高血压患者应该进行常见的继发性高血压筛查。
[0003]嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PPGL)是继发性高血压的主要原因之一，嗜铬细胞瘤约占总高血压人群1％，至少270万，即每1000个人里面就有1.7个人是嗜铬细胞瘤患者；另一方面，每年新发300万高血压，其中约3万人是嗜铬细胞瘤。嗜铬细胞瘤可引起患者血压升高，造成心、脑、肾等严重并发症，临床表现可为引起持续性(50％)、阵发性高血压(30％)、血压正常(10％)；常伴头痛、心悸、多汗三联征，并伴有糖、脂代谢异常，患者可因长期高血压致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象(出现心、脑、肾等多器官系统功能障碍，如心肌梗塞、心律失常、心源性休克；肺水肿、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；脑血管意外；肾功能衰竭等；严重者导致休克，最终致呼吸、循环衰竭死亡)，危及生命；但如能及时、早期获得诊断和治疗，是一种可治愈的继发性高血压病，约90％的嗜铬细胞瘤可通过手术得以治愈。因而其早期诊断甚为重要；然而美国大型第三方诊断机构梅奥诊所Mayo Clinic尸检结果显示，早期嗜铬细胞瘤误(漏)诊率高达75％，约25％的嗜铬细胞瘤系影像学偶然发现，因此嗜铬细胞瘤的筛查必须采用高灵敏高特异的指标及先进的检测方法。
[0004]嗜铬细胞瘤最大的特点是分泌大量的儿茶酚胺及其代谢产物，根据《内科学》高等教育出版社第8版、《中国高血压防治指南》2018版、《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断和治疗临床实践指南》2014版、《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》2020版及重要杂志(如Lancet、N Engl J Med、JAMA)：血、尿儿茶酚胺类及其代谢产物浓度监测是嗜铬细胞瘤筛查、诊断的首选生化指标。
[0005]随着技术的不断进步，液相色谱
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串联质谱法LC
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MS/MS法由于灵敏度高、特异性强和干扰相对较低、多指标同时分析等优势，被誉为小分子定量分析的金标准，相关专家共识及国内外临床实践指南均建议使用LC
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MS/MS法测定儿茶酚胺类物质，降低实验成本、提高检测通量。因而通过LC
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MS/MS全面检测儿茶酚胺及代谢物能明显提高嗜络细胞瘤诊断的敏感性和特异性，高效筛查由此引发的继发性高血压等心脑血管疾病。
[0006]嗜铬细胞瘤在人体内转移速度较慢，释放到血液中的儿茶酚胺含量较低，但儿茶酚胺最终会通过代谢物的方式以尿的形式排出，患者的尿液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢物会显著升高，这对嗜铬细胞瘤的准确诊断有较大帮助。由于患者饮水及肾功能代谢水平的差异等原因，会影响患者尿中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物浓度，因此临床上一般以患者
24小时尿液作为检测样本。
[0007]临床上24小时尿液留样周期较长，儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物等物质极易氧化，稳定性较差；同时取样不便捷，病人依从性较差，不适合门诊检查尤其是门诊检查中的外地患者，因此临床上主要以采血，检测血液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物。随机尿采样便捷，可改善临床留样流程，随时可取尿液样本，不严格要求定时，缩短检测周期，诊断时间短，同时减少医疗费用支出(如住院床位占用等)。尿中肌酐常用于尿液中非法物质排泄时的浓度校正，以尿中肌酐的含量校正尿液中儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物浓度，能降低肾功能、饮水等因素对结果的影响。尿液中肌酐含量较高，每mL尿液中肌酐含量以mg计，而尿液中儿茶酚胺含量为ng水平；肌酐极性大在普通色谱柱上无保留；此外分别测定肌酐及儿茶酚胺浓度会增加检测时长及检测费用。
[0008]中国专利申请公布号CN109959738A，专利技术名称“检测24H尿中儿茶酚胺含量的液质分析方法”针对尿液样本中的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺三种儿茶酚胺进行测定，该专利方法在样本前处理过程中使用到固相萃取技术，增加了方法的成本及时间，且检测指标未涉及儿茶酚胺代谢物及肌酐。
[0009]中国专利申请公布号CN113917007A，专利技术名称“检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢产物的试剂盒及检测方法”对24H尿液中6种儿茶酚胺及中间代谢产物进行测定，该专利方法使用乙醛溶液衍生技术对24H尿液中的6种儿茶酚胺及中间代谢产物进行测定，该专利技术样本前处理简单快捷，儿茶酚胺衍生后状态更为稳定，但是该专利技术未包含儿茶酚胺的最终代谢产物香草扁桃酸、高香草酸进行测定，且试用样本类型为24H尿液样本。
[0010]中国专利申请公布号CN10746262647A嗜铬细胞瘤诊断试剂盒及其使用方法，该专利采用固相萃取法测定随机尿液中的3种儿茶酚胺代谢产物及肌酐，固相萃取柱经活化平衡后，将待测样本溶液上样至固相萃取柱，固相萃取柱选择吸附目标成分，通过淋洗将干扰物去除，再用洗脱溶剂将目标物从固相萃取柱洗脱，达到分离和净化的目的，洗脱液经真空浓缩旋干复溶后，经液相色谱仪测定。其缺点在于操作步骤繁琐、耗时较长，包括活化、上样、淋洗、洗脱、旋干等步骤，又未使用内标物质进行定量，这对稳定性较差的儿茶酚胺类物质检测结果有较大影响，且液相色谱法检测通量及定性能力相比三重四级杆质谱均较差。
[0011]因此，临床迫切需求一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法。

技术实现思路

[0012]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，利用丹磺酰氯衍生技术将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为较为成稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆质谱仪检测。经过一系列实验证明方法的可靠性和稳定性。
[0013]本专利技术还提供了一种能同时快速测定随机尿中肌酐及8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的试剂盒。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0015]本专利技术首先提供了一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，所述检测方法
包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据；其中，所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物为：香草扁桃酸VMA、高香草酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：采用肌酐Cre校正，利用丹磺酰氯衍生法将尿液样本中的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物转化为稳定的衍生物，利用高效液相色谱仪将肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物进行分离后，经三重四级杆串联质谱仪同时测定尿液中肌酐和8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度以及处理数据；其中，所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物为：香草扁桃酸VMA、高香草酸HVA、去甲变肾上腺素NMN、去甲变肾上腺素MN、3
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甲氧酪胺3
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MT、去肾上腺素NE、去甲变肾上腺素E以及多巴胺DA。2.根据权利要求1所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤为：1)定标曲线配制：配制六种浓度的校准品1
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6，每种浓度的校准品中均含所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物以及肌酐；2)混合内标工作液的配制：配制所述的8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的甲醇溶液混合母液以及肌酐母液，用释放剂A稀释至混合内标工作液；其中，混合内标工作液中8种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的浓度为：8μg/mL的VMA
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d3，8μg/mL的HVA
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d3，100ng/mL的NMN
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d3，100ng/mL的MN
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d3，500ng/mL的3
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MT
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d4，100ng/mL的NE
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d3，100ng/mL的E
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d6与500ng/mL的DA
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13C6，混合内标液中肌醇的浓度为50μg/mL的Cre
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d3；3)质控品配制：将经过测试后的人工尿液基质，按照99mL人工尿液，加入1mL浓盐酸，混匀后作为质控基质，加入儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物混合标准品，配制低浓度以及高浓度质控品；4)样品前处理：中段尿液样本采集；将中段尿液样本、步骤1)的标准品1
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6、步骤2)的混合内标工作液、步骤3)的低浓度以及高浓度质控品于离心管中，涡旋混匀，离心，取上清液；向上清液中加入释放剂B与衍生液，涡旋混匀，恒温震荡反应，加入释放剂C涡旋后，高速离心，取上清液；5)将步骤4)的上清液经相色谱三重四级杆串联质谱检测；6)数据处理：由仪器自带软件MassLynx采集分析物及其内标的色谱图并正确积分，采用同位素内标法定量，1/x为权重，以各化合物与其同位素内标峰面积之比为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标绘制校准工作曲线，用校准曲线校准样本及质控品，得出各化合物的浓度。3.根据权利要求2所述的一种儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述的释放剂A为0.1％甲酸，50
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100％乙腈水溶液。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：周兵，吴超超，高强，薛建有，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：