一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明专利技术设计多对引物、探针并进行测试，挑选最优引物、探针组合，检测限更低；此外，本发明专利技术提供的引物探针组合，不需要额外添加剂，如PCR稳定剂、增效剂等，试剂成分更简单，操作更简便，成本更低。本更低。本更低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒


[0001]本专利技术属于基因检测领域，涉及一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒。

技术介绍

[0002]ApoE是人体载脂蛋白之一。载脂蛋白是脂蛋白颗粒成分，参与脂蛋白合成、分泌、加工和代谢，在血液脂质代谢中有重要作用。ApoE基因多态性在高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病早期及发展过程中发挥重要作用。另外，有研究表明，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，其多态性与阿尔茨海默病的易感性显著相关。
[0003]对于ApoE的基因检测主要是位于112位氨基酸的碱基(C.388T>C，Cys130Arg)和158位氨基酸的碱基(C.526C>T，Arg176Cys)。依据112和158位氨基酸的不同组合，形成三种ApoE，即E2、E3和E4，在人群占比分别为8％，78％，14％，其中ApoE3是野生型基因，E3的112、158位氨基酸分别是半胱氨酸和精氨酸，Apo E2、E4分别是突变型，E2在112位和158氨基酸都是半胱氨酸，E4的112位和158位氨基酸都是精氨酸。根据2个SNP基因的不同，ApoE基因可以产生6种常见基因型，包括3种纯合型(E2/E2、E3/E3、E4/E4)和三种杂合型(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。自然人群中，E3基因频率分布最高，在中国人群中，ApoE3/E3表型分布约占70％。
[0004]目前对于ApoE这两个位点的检测主要有直接测序法、基因芯片杂交法、PCR
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Taqman MGB探针分型法、ARMS
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PCR法和PCR
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熔解曲线法。
[0005]直接测序法是SNP分型的“金标准”，但是操作复杂、周期长、通量低、成本高；
[0006]芯片杂交法操作复杂，需要经PCR后的产物与探针杂交，辨别颜色变化进行基因分型，需要开盖操作、容易污染；人眼识别，容易出错；实验周期也较长；
[0007]Taqman(MGB)探针分型通过对一个位点设以对特异性引物及两个探针(一个探针对应一种基因突变)，实现基因分型，是目前CFDA批准试剂盒主要的检测方法。但是该方法需要针对一个位点设计两个探针，成本较高，并且MGB探针有专利保护，使用受限。
[0008]ARMS
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PCR，等位基因特异性扩增法，也称扩增阻碍突变系统，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5
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端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3
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端引物进行平行PCR，只有突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物，由于错配位于引物的3
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端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。该方法通过采用PCR反应结束后进行电泳，从有无扩增条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的一起，但电泳操作，增加了PCR污染的结汇，而且耗时费力。
[0009]基于不对称PCR的熔解曲线法也是目前常用的基因检测方法，将不对称PCR技术与溶解曲线技术相结合，针对ApoE基因的2个SNP位点，分别设计一对引物和一条探针。使用不同浓度的上下游引物进行不对称扩增，随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物则继续进行线性扩增，富集到了大量的含有C.388T>C和C.526C>T的DNA单链。经熔解曲线分析，两个位点探针与对应序列结合，突变与野生型序列退火温度存在差异，进而可以区
分两个位点基因型。专利技术CN111269978B提供了一种通过熔解曲线法进行ApoE基因分型的引物探针及其试剂盒。其对两个位点进行了同种荧光标记并添加PCR增效剂进行扩增反应。通过其公布的技术发现，E2位点两个基因型退火温度分别为57.5℃和61.5℃，另一个位点退火温度为63℃和67.5℃，其中E2位点的61.5℃和E4位点的63℃温度差异很小，实际检测中由于退火温度偏差而导致判断错误；另外，其专利技术中添加的增效剂虽然有可增加其反应效果，但是额外试剂的添加一方面增加了反应成本，另一方面也使得反应操作更加复杂。
[0010]综上所述，现有ApoE基因分型检测方法都或多或少存在操作复杂、检测成本高、周期长、易产生污染及产生一定假阳性等缺陷。

技术实现思路

[0011]为了改善现有技术缺陷，本专利技术提供了一种检测人ApoE基因突变的引物探针组及试剂盒，通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行反复测试优化，可准确区分两个位点的基因型。没有其他增效剂的存在，同时针对两个位点探针进行不同荧光标记(退火温度差一个位点大于5℃，一个位点大于10℃)，操作更简便，分析也更简便、容易、明了。
[0012]本专利技术基于taqman探针熔解曲线法对ApoE基因多态性进行检测。通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行优化，可实现对这两个位点的准确分型。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0014]一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；
[0015]所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0016]所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0017]在本专利技术中，本专利技术基于taqman探针熔解曲线法对ApoE基因多态性进行检测。通过对ApoE突变位点设计特异性引物、探针，并对其浓度比例进行优化，可实现对这两个位点的准确分型。
[0018]根据NCBI dbSNP网站下载的目标SNP C.388T>C和C.526C>T附近序列，利用Primer5.0和Oligo6.0，分别设计针对APOE基因两个位点特异扩增引物和探针，并对引物、探针进行序列比对，选取特异性高的序列。
[0019]同时，为保证统一位点不同基因型能够很好区分开，对探针序列、长度及SNP位置进行优化设计，使其两种基因型对应的温度差异尽可能大。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，所述的检测探针5
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端标记荧光基团修饰，3
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端标记淬灭基团修饰。
[0021]作为本专利技术的一种优选方案，所述荧光基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种，淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，包括检测ApoE T388C引物对与探针以及检测ApoE C526T引物对与探针；所述检测ApoE T388C引物对与探针包括：388F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，388R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针388P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述检测ApoE C526T引物对与探针包括：526F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，526R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针526P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.根据权利要求1所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，所述的检测探针5
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端标记荧光基团修饰，3
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端标记淬灭基团修饰。3.根据权利要求2所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团选自ROX、FAM、HEX、VIC、NED、TET、JOE、CY3、CY5、CY7或AMCA中的一种，淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或QYS
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7中的一种。4.根据权利要求3所述的一种检测人ApoE基因突变的引物探针组，其特征在于，探针388P的荧光基团为FAM，猝灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：高强，牛成镇，吴超超，朱建国，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：