一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法技术

本发明专利技术公开了一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，所述方法包括将待测样本放置于自动化仪器中，通过自动化仪器进行样本前处理，处理完成后进行液相色谱串联质谱检测，同时检测待测样本中的维生素A、维生素D2、维生素D3以及维生素E。本发明专利技术实现脂溶性Vitamin A,25

【技术实现步骤摘要】
一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法


[0001]本专利技术属于分析
，涉及维生素的检测，尤其涉及一种基于磁性固相萃取的全自动样本前处理联合检测脂溶性维生素(Vitamin A,25
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(OH)VD2,25
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(OH)VD3,Vitamin E)的液相色谱串联质谱方法。

技术介绍

[0002]维生素是维持人体生命活动必须的一类物质，也是人体所需的六大营养素之一，主要参与机体代谢的调节。维生素在体内不能合成或合成量极微，必须要从食物中获取。世界卫生组织报告指出：人类常见疾病有135种，其中106种疾病与微量营养素的摄取不足有关。潜在性维生素缺乏病是现代医学的盲点，有专家推测，大约3个人中就有1个可能处于潜在性维生素缺乏症。
[0003]维生素A(Vitamin A)过量会导致维生素A过剩症、肾功能不全、甲状腺功能减退症。维生A缺乏会引起维生素A缺乏症(夜盲症、干眼症、角膜软化病)、脂类吸收不良综合征、毛囊角化增生症、锌缺乏症、肝损害、阻塞性黄疸、甲状腺功能亢进症，外伤等。儿童期维生素D缺乏会引起营养缺乏性佝偻病，维生素D(25
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(OH)VD3)缺乏的儿童发生高血糖的概率是正常儿童的2.5倍，高血压的概率为2.4倍，代谢综合征的概率为4倍。
[0004]维生素D缺乏在儿童自闭症的发病风险为正常儿童的1.17倍。成人期维生素D缺乏会引起骨软化症。老年期缺乏会引起骨质疏松。维生素E过量会导致出血性脑卒中。维生素E缺乏会增加流感的发病率。根据维生素D的流行病学：北方地区孕妇及新生儿几乎100％缺乏,南方也有40％～90％；儿童VD缺乏在北方30％～70％，南方10％～40％；中老年人VD缺乏北方80％～90％。
[0005]维生素E(Vitamin E)是一种强的抗氧化剂，能有效地阻止食物和消化道内脂肪酸的酸败，保护细胞免受不饱和脂肪酸氧化产生的有害物质的伤害；可增强毛细管的抵抗力，维持正常的通透性，预防心血管疾病。据报道，维生素E缺乏会引发癌症的发生。维生素E缺乏症的表现是多方面的，但对生殖，肌肉，心血管和造血系统的各种作用最重要。综上所述，预防控制维生素相关疾病、提高出生人口素质、改善其营养状况是目前纲要实施亟待实现的目标。准确定量维生素在人体内的水平，有助于指导医生合理补充多种维生素矿物质，改善人体营养素的营养状况，保证国民的正常生长发育，骨骼发育，智力发育，以及改善免疫功能都是有益的。
[0006]在人体脂溶性维生素检测常用方法主要包括，蛋白沉淀法，液液萃取法，固相萃取法，免疫磁珠法。蛋白沉淀法通常使用有机溶剂，强酸，中性盐沉淀蛋白取上清液上机分析，样本净化效率低，容易造成色谱柱的堵塞和质谱仪器的污染。液液萃取法通常使用正相的有机溶剂(正己烷，甲基叔丁基醚，乙酸乙酯)，样品需要氮吹，有机溶剂容易挥发，对实验室环境及人员不友好。固相萃取法同时使用SPE板净化样本，样本净化效果较好，但是SPE固相填料容易被有机溶剂溶胀，批次间的均一性较差，SPE固相萃取方法耗材成本较高，不适用大批量临床样本检测。
[0007]免疫磁珠法通常用特定抗体包被的磁珠定向捕获化合物，一般采用竞争法检测，不适用于质谱检测器检测。小分子化合物只有1
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2个抗原决定簇，一方面会造成抗体的筛选的成本会很高，另外一方面小分子结构域比较类似，很容易对结构类似物有明显的交叉反应。
[0008]例如中国专利CN201810833326.0公开的一种定量检测血浆中5种脂溶性维生素的试剂盒及方法，该方法基于固相支撑液液萃取及适配的自动移液站对血浆中的脂溶性维生素提取，使用正己烷强挥发性有机溶剂，对实验人员身体造成一定影响，方法需要沉淀蛋白，萃取，氮吹，复溶，操作复杂，不易实现操作的自动化处理。
[0009]例如中国专利CN114487209A公开的基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法需手动对样本进行添加内标，洗脱目标化合物后手动加水稀释减少溶剂效应，不能实现全自动化样品前处理，不能实现临床检测中的高效，高通量的需求。
[0010]例如中国专利CN114019069A公开的生物样品中小分子物质检测的前处理试剂，该方法添加内标，混匀，加磁珠，洗涤，洗脱转移至96孔板，上机测试。试验步骤完全需要实验员操作进行，操作步骤比较繁琐，25
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(OH)D3不能与维生素A,E联合测定。
[0011]因此，现有检测人体脂溶性维生素检测常用方法的主要缺陷在于：
[0012](1)不能实现脂溶性维生素联合检测。
[0013](2)方法需对样本手动进行添加内标，手动加水稀释洗脱液，费时费力，不能实现样本前处理的全自动，不利于提高临床质谱检测的高通量，高效率。

技术实现思路

[0014]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，本专利技术基于磁性固相萃取的全自动样本前处理联合检测脂溶性维生素(Vitamin A,25
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(OH)VD3,Vitamin E)的液相色谱串联质谱方法，具有使用简便，成本较低，前处理快速，准确度高、灵敏度高、精密度高、分析时间短等特点，避免人工操作带来的误差，节约人力。
[0015]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0016]一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，所述方法包括将待测样本放置于自动化仪器中，通过自动化仪器进行样本前处理，处理完成后进行液相色谱串联质谱检测，同时检测待测样本中的维生素A、维生素D2、维生素D3以及维生素E。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，所述自动化仪器包括平台、机械手、液泵组件、蠕动泵、清洗盘、柱塞泵组件、底物装载组件、自动进样模块、试剂盘模块、加液臂、混匀稀释模块、反应杯装载模块、废杯滑道以及洗脱液收集模块；其中，所述试剂盘模块包含试剂盒，所述试剂盒包括内标液A1、解离液A2与磁珠液A3。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，所述方法的具体步骤为：
[0019]1)采血管样本放置于自动进样模块，加液臂转动加液针取50
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200μL待测的样本；
[0020]2)加液臂转动加液针取100
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300μL试剂盒内标液，样品杯转移至混匀稀释模块，震荡30s；孵育盘孵育；
[0021]3)自动化仪器加液臂转动加液针依次取200
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400μL解离液，取50
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150μL磁珠液，加
入到已经与内标混合的样本杯，孵育盘孵育；
[0022]4)样本孵育完成后，自动化仪器转液臂移动反应杯至清洗盘，清洗盘依次对样本清洗1
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4次后，加入洗脱液100
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300μL；
[0023]5)自动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，所述方法包括将待测样本放置于自动化仪器中，通过自动化仪器进行样本前处理，处理完成后进行液相色谱串联质谱检测，同时检测待测样本中的维生素A、维生素D2、维生素D3以及维生素E。2.根据权利要求1所述的一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，所述自动化仪器包括平台、机械手、液泵组件、蠕动泵、清洗盘、柱塞泵组件、底物装载组件、自动进样模块、试剂盘模块、加液臂、混匀稀释模块、反应杯装载模块、废杯滑道以及洗脱液收集模块；其中，所述试剂盘模块包含试剂盒，所述试剂盒包括内标液A1、解离液A2与磁珠液A3。3.根据权利要求2所述的一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：1)采血管样本放置于自动进样模块，加液臂转动加液针取50
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200μL待测的样本；2)加液臂转动加液针取100
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300μL试剂盒内标液，样品杯转移至混匀稀释模块，震荡30s；孵育盘孵育；3)自动化仪器加液臂转动加液针依次取200
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400μL解离液，取50
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150μL磁珠液，加入到已经与内标混合的样本杯，孵育盘孵育；4)样本孵育完成后，自动化仪器转液臂移动反应杯至清洗盘，清洗盘依次对样本清洗1
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4次后，加入洗脱液100
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300μL；5)自动化仪器转液臂模块移动反应杯至磁吸分离模块，吸取剩余的液体至96孔板；6)自动化仪器混匀稀释模块在线加入稀释液20
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100μL至96孔板，进行液相色谱串联质谱检测。4.根据权利要求3所述的一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，所述步骤2)中，在孵育盘中孵育的时间为1
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5min，每隔15s时间200
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800rpm/min混匀1
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3s。5.根据权利要求3所述的一种检测脂溶性维生素的液相色谱串联质谱方法，其特征在于，所述步骤3)中，在孵育盘...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘纪松，吴超超，高强，
申请(专利权)人：杭州佰辰医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：