基于光学微球的快速灵敏微小RNA检测方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体为一种基于光学微球的快速灵敏微小RNA检测方法。本发明专利技术采用折射率高于环境的透明材料光学微球作为检测载体；微球粒径为微米级别；所述微球表面经过特异性捕获DNA序列修饰处理；利用微球荧光增强效应，实现目标微小RNA序列的快速和灵敏检测。本发明专利技术方法无需扩展、检测速度快、所需样品量少、灵敏度高；且微球尺寸较小，还可发展为现场、便携式微小RNA检测设备。便携式微小RNA检测设备。便携式微小RNA检测设备。

【技术实现步骤摘要】
基于光学微球的快速灵敏微小RNA检测方法


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种基于光学微球的微小RNA检测方法。

技术介绍

[0002]微小RNA(MicroRNA,miRNA)是人体内一类小的非编码RNA，参与人体内的多种调控过程，并作为生物标记广泛用于肿瘤等多种疾病的诊断和病程监测。miRNA在体内具有表达量低、序列较短、同源性较高等特点，对检测方法提出了很高的要求。目前，miRNA的主要检测方法包括Northern blot，qRT
‑
PCR，原位杂交等。其中，Northern blot与原位杂交灵敏度较低、检测步骤繁琐，而qRT
‑
PCR则需要复杂的引物设计，且扩增会带来假阳性等问题。由于上述方法均存在各自限制，难以实现临床场景下的简便、快速、高灵敏度检测。
[0003]固相杂交技术通过在固相载体表面修饰已知序列的核苷酸探针，可以实现对目标序列的高特异性分析，且可以根据不同的检测需求选择不同报告基团或标记方法，能够满足更为广泛的现实应用情况。然而，固相杂交技术通常会面临低灵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于光学微球的快速灵敏微小RNA检测方法，其特征在于，将微球荧光增强与固相杂交技术相结合，采用折射率高于环境的透明材料光学微球作为检测载体，微球粒径为亚毫米级别；所述微球表面经过特异性捕获DNA序列修饰；利用折射率较高的微球界面的荧光非对称发射效应，使荧光发射绝大多数光线处于折射率较高的介质中，并在微球中实现多次反射而对荧光发射实现扩增，实现微小RNA的快速和灵敏检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微球表面经过特异性捕获DNA序列修饰，具体步骤为：(1)微球表面羟基化：利用Piranha溶液将各微球表面进行羟基化处理；Piranha溶液由浓硫酸与双氧水按体积比7:3混合配制，待溶液冷却后，浸泡微球，室温振摇35
‑
45min；浸泡后的微球用0.1
‑
0.3M NaOH溶液清洗，并用0.1
‑
0.3M NaOH溶液浸泡，室温振摇5
‑
15min；浸泡完成后用蒸馏水清洗，室温晾干；(2)微球表面APTES氨基化：将干燥的微球浸入1.5
‑
2.5％(v/v)的3
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，室温摇床反应1.5
‑
2.5小时；反应结束后丙酮清洗，室温晾干；(3)微球表面PDITC桥连分子修饰：将微球浸入0.1
‑
0.3％(v/v)由10％吡啶/N,N
‑
二甲基甲酰胺配制的PDITC溶液中，37℃摇床反应1.5
‑
2.5h；反应结束后，甲醇清洗5次，丙酮清洗2次，蒸馏水清洗1次，室温晾干；(4)微球表面多余氨基位点封闭：取醋酸酐、四氢呋喃、吡啶按体积比6:3:1混合，三乙胺调节pH至9.0，即获得氨基封闭液；将桥连分子修饰微球浸泡于上述氨基封闭液，25℃反应15
‑
45分钟；反应结束后，蒸馏水清洗，室温晾干；(5)微球表面特异性捕获DNA序列的修饰：利用1
×
TE缓冲液配制0.5
‑
5μM目标miRNA特异性捕获DNA序列溶液，浸泡微球，于4℃振摇反应2
‑
12小时；反应完成后去除反应液，将微球置于37℃潮湿环境中水化1.5
‑
2.5小时，随后用1％氨水清洗1次，二次蒸馏水清洗3次，室温晾干；(6)微球表面非特异性结合位点的封闭：取变性鲑鱼精DNA与BSA组成的封闭液，将捕获DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾湖烈，魏子恒，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：