【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杂交捕获方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年3月26日提交的美国临时专利申请No.63/000,140的优先权,所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
[0003]本文描述了用于改进杂交捕获以从核酸群中富集靶核酸序列的方法和组合物。一方面,所述方法和组合物可用于下一代测序(NGS)应用。
技术介绍
[0004]在DNA和RNA分析中,在复杂样本、例如来自一个基因组、多个基因组、cfDNA、ctDNA、RNA或FFPE样本的样本内询问选定的靶序列群来检测多重变化往往是更有效率的。选定的序列被靶向分离(“靶标捕获”),用于下游工作流程,例如扩增、现场即时检测、测序、或化学/生物增殖。
[0005]靶标捕获的两种方法是杂交靶标捕获(杂交
‑
捕获)或多重PCR(扩增子富集)。
[0006]多重PCR技术快速、灵敏,并且通常提供简单高效的工作流程,这往往是对用户友好的。然而,可以同时询问(捕获)的靶序列的数量限于最多几千个PCR
‑
引物对。此外,连续长序列(数千碱基)的不间断呈现、捕获均一性和定量测量具有挑战性。有些多重PCR挑战通常通过现有杂交捕获技术来解决。
[0007]其它方法,例如分子倒置探针(MIP)或锁式探针,也遇到了基于扩增子富集的方法的类似变化。
[0008]商业杂交
‑
捕获(杂交
‑
捕获)方法有很多种。对于杂交
‑
捕获,核 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于富集样本中的核酸靶序列群的方法,所述方法包括:(a)提供包含多个靶核酸序列和多个脱靶核酸序列的核酸分子样本;(b)在杂交条件下将所述样本和与所述多个靶核酸序列互补的核酸探针组杂交以生成探针/靶标复合物;(c)选择性固定化所述探针/靶标复合物以形成固定化的探针/靶标复合物;(d)将所述固定化的探针/靶标复合物加热至等于或低于所述探针/靶标复合物的总T
m
的温度,持续一段足以解离所述脱靶核酸序列的时间;和(e)洗涤所述固定化的探针/靶标复合物以从杂交的多个靶核酸序列中去除未杂交的核酸序列和脱靶核酸序列,从而富集所述样本中的所述多个靶核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法,其中与所述多个靶核酸序列互补的核酸探针组还包含捕获部分。3.根据权利要求2所述的方法,其中所述捕获部分是生物素。4.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括杂交缓冲液,所述杂交缓冲液包含以下一种或多种:(a)盐,选自以下一种或多种:一价盐、二价盐、钠盐、铵盐、铯盐或锰盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、异硫氰酸盐或胍盐;(b)螯合剂,选自以下一种或多种:乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β
‑
氨乙基醚)
‑
N,N,N
′
,N
′‑
四乙酸(EGTA)、或(1,2
‑
双(邻氨基苯氧基)乙烷
‑
N,N,N
′
,N
′‑
四乙酸(BAPTA);(c)缓冲剂,选自以下一种或多种:三(羟甲基)氨基甲烷(Tris);2
‑
(双(2
‑
羟乙基)氨基)乙酸)(Bicine);(N
‑
[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine);[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(TAPS);3
‑
[N
‑
三(羟甲基)甲氨基]
‑2‑
羟基丙磺酸(TAPSO);4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸(HEPES);2
‑
[[1,3
‑
二羟基
‑2‑
(羟甲基)丙烷
‑2‑
基]氨基]乙磺酸(TES);3
‑
(N
‑
吗啉代)丙磺酸(MOPS);哌嗪
‑
N,N
′‑
双(2
‑
乙磺酸)(PIPES);2
‑
(N
‑
吗啉代)乙磺酸(MES);或二甲基砷酸(甲次砷酸盐);(d)去污剂,选自以下一种或多种:十二烷基硫酸钠(SDS)、聚山梨醇酯20(20)、辛基酚乙氧基化物(Triton X
‑
100)、辛基酚聚氧乙烯醚(
‑
CA 630)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP
‑
40)、或西曲溴铵(CTAB);或(e)添加剂,选自以下一种或多种:甘氨酸、甜菜碱、甘氨酸
‑
甜菜碱、7
‑
脱氮
‑2′‑
脱氧鸟苷、二甲亚砜(DMSO)、聚乙二醇400
–
1,000,000、甘油、镁、四甲基氯化铵(TMAC)、四乙基氯化铵(TEAC)、三乙胺盐酸盐、碳酸亚乙酯、硫酸葡聚糖、或牛血清白蛋白(BSA)。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述杂交缓冲液含有甲酰胺。6.根据权利要求4所述的方法,其中所述杂交缓冲液不含甲酰胺。7.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括温育时间从约10分钟至约48小时。8.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括温育时间从约2小时至过夜。9.根据权利要求8所述的方法,其中与过夜温育时间相比,用2小时温育时间达到等效的特异性和等效的收率。10.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括温育温度从约55℃至约75℃。11.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括温育温度从约60℃至约70℃。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交条件包括温育时间约2小时和温育温度约65℃。13.根据权利要求1所述的方法,其中使用链霉亲和素珠选择性固定化所述探针/靶标复合物。14.根据权利要求1所述的方法,其中在包括从约10分钟至约48小时的温育时间的条件下,选择性固定化所述探针/靶标复合物。15.根据权利要求1所述的方法,其中在包括温育温度从约20℃至约40℃的条件下,选择性固定化所述探针/靶标复合物。16.根据权利要求1所述的方法,其中在包括温育时间约30分钟和温育温度为室温的条件下,选择性固定化所述探针/靶标复合物。17.根据权利要求1所述的方法,其中所述固定化的探针/靶标复合物的加热包括解链缓冲液,所述解链缓冲液包含以下一种或多种:(a)盐,选自以下一种或多种:一价盐、二价盐、钠盐、铵盐、铯盐或锰盐、氯化物、柠檬酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、异硫氰酸盐或胍盐;(b)螯合剂,选自以下一种或多种:乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β
‑
氨乙基醚)
‑
N,N,N
′
,N
′‑
四乙酸(EGTA)、或(1,2
‑
双(邻氨基苯氧基)乙烷
‑
N,N,N
′
,N
′‑
四乙酸(BAPTA);(c)缓冲剂,选自以下一种或多种:三(羟甲基)氨基甲烷(Tris);2
‑
(双(2
‑
羟乙基)氨基)乙酸)(Bicine);(N
‑
[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine);[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(TAPS);3
‑
...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。