一种检测miR-92a的探针、试剂盒及在制备结直肠癌早期检测产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测miR

【技术实现步骤摘要】
一种检测miR
‑
92a的探针、试剂盒及在制备结直肠癌早期检测产品中的应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤分子诊断
，特别涉及一种检测miR
‑
92a的探针、试剂盒及在制备结直肠癌早期检测产品中的应用。

技术介绍

[0002]我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发病率和死亡率逐年上升，每1.5分钟就有一人被确诊为CRC，每5分钟就有1人死于CRC。由于CRC发病的早期无特异症状，一般确诊时已发展到中晚期，因此治疗效果差，死亡率高。如果在CRC发病的早期阶段可以及时诊断并进行治疗，则可提高其治愈率，因此早期筛查是防治CRC的首要措施。目前，我国针对CRC的筛查方法主要是CRC高危因素问卷调查和粪便隐血(FOB)检查，其中一项阳性或者两项均阳性者，即被列入高危人群，并建议进行结肠镜检查。但粪便隐血检查的准确率极低，同时由于结肠镜检查的流程复杂、费用高、痛苦大、风险大等弊端，导致目前针对CRC的筛查依从性较差。因此，一种高灵敏、高特异、依从性高的筛查技术亟待被开发。
[0003]MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20
‑
24个核苷酸的小RNA，其通过抑制mRNA的翻译而在细胞内具有重要的调节作用。Michael等人2003年首次发现一些miRNAs如miR
‑
143和miR
‑
145等在CRC组织中表达下降，提示了miRNAs作为CRC标志物的潜在价值。目前，PCR是检测粪便miRNA的最主要检测方法。但PCR方法对样本中核酸分子的完整性要求比较高，并且粪便中存在大量的PCR酶的抑制剂，因此处理粪便样本的过程比较复杂，而且提取出来的核酸用PCR法扩增的效果不佳。另外，PCR反应需要相关的PCR仪来进行，对相关检测试剂以及配套耗材有着比较高的要求。所以，专利技术人认为，提供一种抗干扰强、不受粪便中PCR抑制剂影响的检测粪便中miRNA的方法是非常有必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种检测miR
‑
92a的探针、试剂盒及在制备结直肠癌早期检测产品中的应用。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案得以实现的。
[0006]一种检测miR
‑
92a的探针，所述探针的核酸序列为5
’‑
TTACAGGCCGGGACAAGTGCAATATT
‑3’
(SEQ ID NO.1)。
[0007]一种检测miR
‑
92a的探针，所述探针为SEQ ID NO.1所示核酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸序列，且其与SEQ ID NO.1所示的核酸序列功能相同或相似。
[0008]一种检测miR
‑
92a的探针，所述探针为与SEQ ID NO.1所示核酸序列至少有80％同一性的核酸序列。
[0009]作为检测miR
‑
92a的探针的优选方案，所述探针的两端分别用地高辛和生物素标记。即所述探针的5
’
端用生物素标记，3
’
端用地高辛标记；或所述探针的5
’
端用地高辛标
记，3
’
端用生物素标记。
[0010]一种上述检测miR
‑
92a的探针在制备结直肠癌早期检测产品中的应用。
[0011]一种检测miR
‑
92a的试剂盒，所述试剂盒包括上述探针。
[0012]作为检测miR
‑
92a的试剂盒的优选方案，所述试剂盒还包括包被有特异性抗体的固相载体、酶标记的亲和素或链霉亲和素、酶发光底物。
[0013]作为检测miR
‑
92a的试剂盒的优选方案，所述特异性抗体选用地高辛抗体；所述酶选用碱性磷酸酶或辣根氧化酶；所述酶发光底物选用化学发光或荧光底物；所述固相载体选用磁珠或96孔微孔板。
[0014]一种上述检测miR
‑
92a的试剂盒在作为结直肠癌早期检测产品的应用。
[0015]作为应用的优选方案，将粪便样本中提取的RNA与探针在缓冲液中进行杂交，将获得的杂交产物转移到固相载体进行孵育杂交，再将含有杂交产物的固相载体依次与酶标记的亲和素和酶发光底物孵育，最后检测固相载体的荧光信号。
[0016]本申请具有以下有益效果。
[0017]1.本专利技术检测miR
‑
92a抗干扰性强：本专利技术检测过程中不涉及PCR酶反应，对核酸纯净度要求低，克服PCR反应易受样品纯度、片段完整性影响的缺点；
[0018]2.本专利技术检测miR
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92a可以做到高通量：本专利技术仅需在最终步骤信号检测时使用酶标仪，之前的所有步骤均可在恒温箱中进行，可以同时进行多个样本测试，具有高通量的特点；
[0019]3.本专利技术检测miR
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92a的操作简单：本专利技术不涉及各种复杂的PCR操作，操作人员仅需要掌握简单的移液枪操作，以及简单的酶标仪使用；
[0020]4.本专利技术通过检测粪便中的miR
‑
92a的表达水平，可以很好的从粪便标本中区分出健康人和结直肠癌病人，具有较好的灵敏度和特异度，具有无创、依从性高的特点。
附图说明
[0021]图1是本专利技术试剂盒检测miR
‑
92a的标准曲线图；
[0022]图2是分别用PCR法和本专利技术试剂盒检测粪便RNA中miR
‑
92a的结果图；
[0023]图3是本专利技术试剂盒检测粪便样本中miR
‑
92a的浓度图；
[0024]图4是本专利技术miR
‑
92a检测结直肠癌的ROC曲线图。
具体实施方式
[0025]下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的说明。
[0026]试剂配置：
[0027]1.探针Biotin
‑
TTACAGGCCGGGACAAGTGCAATATT
‑
Digoxin由上海生工生物工程股份有限公司合成；
[0028]2.DEPC处理水和1XPBS缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；
[0029]3.包被有地高辛抗体的96孔微孔板由天津达济科技有限公司提供；
[0030]4.杂交缓冲液：100mM Tris
‑
HCl,10mM EDTA,2％SDS,40％formamide,5％BSA,0.05mg/ml鲑鱼精DNA，余量是DEPC处理水；
[0031]5.辣根氧化酶标记链霉亲和素购自上海碧云天生物技术有限公司；
[0032]6.稀释液：含0.05％Tween 20,5％BSA的1X PBS缓冲液(pH7.4)；
[0033]7.ECL化学发光检测试剂盒购自北京本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测miR
‑
92a的探针，其特征在于：所述探针的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种检测miR
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92a的探针，其特征在于：所述探针为SEQ ID NO.1所示核酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸序列，且其与SEQ ID NO.1所示的核酸序列功能相同或相似。3.一种检测miR
‑
92a的探针，其特征在于：所述探针为与SEQ ID NO.1所示核酸序列至少有80％同一性的核酸序列。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的检测miR
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92a的探针，其特征在于：所述探针的两端分别用地高辛和生物素标记。5.一种权利要求1
‑
4任一所述的检测miR
‑
92a的探针在制备结直肠癌早期检测产品中的应用。6.一种检测miR
‑
92a的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春泽，贾杨，张锡朋，秦海，刘兆策，马宏，李红洲，
申请(专利权)人：天津市人民医院，
类型：发明
国别省市：